微生物論文

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微生物論文:固定化微生物與游離菌凈化SO2性能的初步對比實驗

摘要：本文對固定化微生物和游離菌凈化SO2的性能進行了初步對比實驗研究，分別測試了固定化微生物與游離菌在液相和氣相環境中對SO2的凈化性能，同時考察了在氣相條件下二者對SO2的凈化效果。實驗表明，利用復合固定化方法即吸附—包埋—交聯法制備的固定化小球，與游離菌相比，對SO2的凈化性能有顯著提高。

關鍵詞：固定化微生物 二氧化硫 降解

0 引 言

我國是以煤為主要能源的國家。1990年煤在一次能源中占76.2%，2000年占70%，預計2050年仍占60~70%[1]，這表明我國以煤為主要能源結構在今后相當長時期內不會改變。

我國煤炭大多數都直接燃燒，因此造成煙塵和SO2等污染物大量排放到環境中，導致我國城市的空氣污染十分嚴重。造成了嚴重的酸雨污染和生態損害。根據有關研究，1995年我國由于酸雨和SO2污染造成農作物、森林和人體健康等方面的經濟損失為1100多億，已接近當年國民生產總值到2.0%[2]。如不嚴格控制，SO2問題將成為制約我國國民經濟發展和社會發展的重要因素，因此，削減和控制燃煤SO2污染是我國能源和環境保護面臨的嚴峻挑戰。

早在50年代，Leathan等（1953年）及Temple等（1954年）就分別發現某些化能自養型細菌與煤中FeS2的氧化有關，并從煤礦廢水中分離出氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacilus ferroxidans）[3]。然而，當時，此發現并未引起足夠的重視，直至70年代，因世界范圍的大氣污染和酸雨問題日益嚴重，世界各國才開始重視與煤炭脫硫有關的微生物研究。

微生物脫硫是利用化能自養微生物對SOX的代謝過程，將煙道氣中的硫氧化物脫除。在生物脫硫過程中，氧化態的污染物如SO2，硫酸鹽、亞硫酸鹽及硫代硫酸鹽經微生物還原作用生成單質硫去除[4]。目前，傳統的生化處理存在著生物濃度低，會產生大量的污泥，并且給后處理帶來麻煩，同時占地面積大，投資高、動力消耗多等問題。這些問題采用傳統方法不能解決，而固定化微生技術卻展現了廣闊的前景[5-6]

固定化微生物技術即固定化細胞技術，是20世紀60年代開始迅速發展起來的一項新技術 ，它是通過化學的或物理的手段將游離細胞或酶定位于限定的空間區域內，使其保持活性并可以反復利用[7]。固定化微生物技術最初主要用于發酵生產，70年代后期，被用到水處理領域，近年來則成為各國學者研究的熱點。固定化生物技術克服了生物細胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次污染的弊端，具有微生物密度高、反應迅速、微生物流失少、產物易分離、反應過程易控制等優點，是一種很有前途的污染物處理技術[8-10]。采用固定化技術可以使微生物封閉在載體內，減少菌體的脫落，同時微生物在載體內可以繁殖，當酶失去活性后，通過培養可恢復其活性而被反復利用[11]。

近年來，隨著世界經濟的發展及工業的進步，環境問題已成為全球性問題，固定化微生物技術作為一種新的處理方法，已成為生物工程和環境工程技術的一個重要分支，越來越受到人們的重視。固定化微生物法凈化低濃度煙氣SO2技術的研究不僅拓展了生物技術在廢氣治理領域的研究與應用，而且為低濃度煙氣SO2的生物治理提供了一個新途徑。因此本研究對固定化微生物與游離菌凈化SO2的性能的進行了對比，以確認固定化微生物法凈化SO2的可行性。

1 實驗條件與方法

1.1菌種培養實驗裝置

本馴化實驗中所使用的菌種溶液為某污水處理廠氧化溝中段的污水，采用誘導馴化方式對菌種進行馴化，即向菌液中每日通入一定量的SO2氣體，并不斷地提高SO2氣體的量，使微生物逐步適應并經多代繁衍。經過一定時間的馴化后，分析菌種對液相中亞硫酸根的降解性能，來判斷菌種對SO2的凈化性能。實驗裝置如圖1所示。

Fig.1 experimental equipment of training microbe

圖中1、2、3為SO2氣體發生裝置，即H2SO4溶液和Na2SO3溶液在3中反應生成SO2氣體，并在風機的作用下，將氣體吹入裝有菌液的馴化裝置6。

1.2固定化微生物制備方法

常用的固定化制備方法可分為三種：吸附法、交聯法和包埋法[12]。現分述如下：

1)吸附法

吸附法是通過靜電吸引或利用載體對細胞的親和性將細胞直接吸附在水不溶性載體上。一般只要把載體放在細胞懸浮液中攪拌或浸泡，然后洗去沒有被吸附的游離細胞，就制成了固定化細胞。該法操作簡單，對細胞活性影響小，但所能固定的細胞數量有限。吸附法分為物理吸附和離子吸附兩種。

2)交聯法

交聯法不使用載體，是利用雙功能或多功能試劑直接與細胞表面的基團如氨基、烴基等進行交聯，使細胞之間相互接成網狀結構。最常用的交聯劑有戊二醛，順丁烯二酸酐、甲苯二異氰酸酯等。此法化學反應激烈，對細胞活性影響大。另外，交聯劑大多價格昂貴，限制了它的廣泛應用。

3)包埋法

包埋法是將細胞包裹在凝膠的網格結構中或者包裹在半透性聚合薄膜內，小分子的底物和產物可以自由擴散，而細胞卻不會擴散到周圍介質中去。包埋的載體主要有聚丙烯酰胺、瓊脂、明膠、K—卡拉膠和海藻酸鈣等。包埋法的優點在于包埋方法簡單、條件溫和，可以保持較高的細胞酶活力，是應用最為廣泛的細胞固定化方法之一[12]。

根據本課題組的前期實驗，增加活性炭的投加量，可使固定化微生物小球的活性和耐酸性均有不同程度的提高，但機械強度基本不變。增加己二胺的投加量，使小球的相對活性、機械強度和耐酸性均有不同程度的增加；交聯時間增加也會使小球的機械強度增強。通過本研究前期正交實驗確定的固定化小球最佳制備工藝，來制備固定化微生物。

本課題的前期實驗研究，分別選用三種復合固定化方法中的最佳條件和包埋法最佳固定條件，制備固定化微生物小球，其性能比較結果如表1所示[13]。

固定方法性能指標 海藻酸鈉包埋法 吸附—包埋復合固定法 包埋—交聯復合固定法 吸附—包埋—交聯法 相對活性% 225.6 261.9 221.3 246.2 機械強度g 27 27 40 42 72h失重率% 36.3 31.7 36.0 28

該結果證明采用復合固定方法即吸附—交聯—包埋復合固定法制備固定化小球，不僅保證了固定化微生物很高的相對活性，而且還提高了固定化小球的機械強度及耐酸性。因此本研究采用復合固定方法即吸附—交聯—包埋復合固定法，以如圖2所示的工藝流程來制備固定化微生物。

圖2 固定化微生物制備工藝流程圖

Fig.2 Flow chart of making immobilized microbial biomass

1.3固定床反應器

以實驗室制備的含SO2氣體為處理對象，將固定化微生物小球填充在固定床內，對其中的SO2氣體行生化處理，其整套凈化實驗裝置流程如圖3所示。

整個流程包括SO2氣體的發生系統和凈化SO2氣體的固定床生化反應器二個部分。實驗中，SO2氣體是通過Na2SO3溶液1和稀H2SO4溶液2在SO2氣體發生器3內反應制得的，并利用風機4將發生器內所生成的SO2氣體由底部直接吹入固定床生化反應器。循環液體由高位槽7進入6內并從頂部向下噴淋到固定化微生物小球上（噴淋液體的主要作用是潤濕固定化微生物小球，向微生物提供生長所需要的氮磷等營養物，同時將微生物的代謝產物帶走），而后由反應器底部排入循環水槽8，再由耐酸泵9打回到高位槽循環使用。SO2氣體在塔內上升的過程中與固定化微生物接觸而被吸收，凈化后的氣體由反應器頂部排出。為了避免造成污染，在尾氣排空前設置了SO2尾氣吸收瓶10。

1.4實驗分析方法

氣相中SO2和液相中SO32-的分析方法采用碘量法。用奧立龍818型精密酸度計測液相pH值。

2實驗結果與討論

2.1在液相環境中凈化SO2能力隨時間的變化比較

將一定濃度的SO32-溶液中分別加入含有等量微生物的固定化微生物和游離菌，每隔一段時間測定溶液中SO32-濃度，并計算出凈化效率。如圖4所示，曝氣量為0.1m3/h時，固定化小球的凈化速率大于游離菌的，在反應開始進行的20分鐘內，固定化小球的凈化速率是增大的，游離菌的基本不變；20min以后，二者的凈化速率都呈下降趨勢。在生化反應的有效時間內，固定化小球的凈化速率高于游離菌的。這表明固定化微生物凈化SO2的性能優于游離菌的性能。

2.2 在不同pH值的液相環境下對SO2凈化性能的比較

因為SO2為酸性氣體，所以只研究在偏酸性環境下固定化微生物和游離菌對SO2的凈化效率。選擇從pH=3到pH=6四個pH值作為實驗點，用NaOH溶液和鹽酸溶液來調節其液相環境的pH值，考慮到NaOH溶液會消耗SO2，因此將pH值調節好后液相中SO32-的濃度作為SO2的初始濃度，測試游離菌與固定化微生物凈化SO2的效率，實驗結果如圖5所示。

圖5顯示固定化小球的凈化效率明顯高于游離菌的，pH=5時固定化小球的凈化效率高達70%，而游離菌的只有30%。這也表明固定化微生物對SO2的凈化性能優于游離菌的凈化性能。

Fig.4 Changing of purification velocity with increasing of time

Fig.5 Effect of pH on purification efficiency

2.3 固定化微生物與游離菌凈化SO2氣體的性能對比研究

將固定化小球裝入如圖3所示的固定床6中，制得的SO2氣體由風機吹入反應器6，在G處測入口濃度，在改變入口濃度的條件下測固定化微生物的凈化效率。在相同的條件下將SO2氣體通入菌液中，在相同的時刻測菌液中SO32-濃度和出口SO2濃度，計算出其凈化效率，結果如圖6所示。當入口濃度為5.1 g/m3時，固定化微生物和游離菌的凈化效率都為98%。但隨著入口SO2氣體濃度的增大，游離菌的凈化效率急劇下降。當入口氣體濃度為7.2g/m3時，游離菌的凈化效率只有40.7%，而固定化微生物的凈化效率仍保持在80%以上。二者的凈化效率都隨著入口濃度的增大而降低，其原因主要是當入口濃度較低時，微生物可以和SO2氣體充分接觸，進而被生化吸收。隨著入口SO2濃度的增加，多余的SO2在較短的時間內未能被微生物吸收凈化，而是隨著氣相主體排出。因此就出現了隨著入口SO2濃度的增加其凈化效率反而下降的現象。

但是，如圖6所示，固定化小球的SO2凈化效率高于游離菌的。其原因主要是因為采用的是好氧微生物，固定化微生物可以與氣相接觸，即可耗用連續相的氣相中的氧來對SO2進行生化吸收，而游離菌主要耗用的是液相中數量有限的溶解氧。因此富氧的反應氣氛是固定化微生物凈化效果優于游離菌凈化效果的一個重要原因。

3結論

本研究對固定化微生物與游離菌凈化SO2的對比實驗結果表明，經固定化后的微生物在液相和氣相環境中均對SO2有較強的凈化去除作用，其凈化性能明顯優于游離菌的凈化性能，因此有繼續開展深入研究的價值和必要。

微生物論文:談產酸相穩定發酵類型微生物生態學研究

論文關鍵詞:產酸發酵反應器　生態因子　頂極群落　生態演替　生態位

論文摘要:通過產酸發酵反應器的動態試驗,考察生態因子(pH、ORP)等制約的不同發酵類型頂極群落的結構、優勢種群的組成和生態演替的規律,闡明不同發酵類型代謝及其頂極群落的典型特征,揭示產酸發酵過程中頂極群落內平衡與反饋調節的生理代謝機制,并以pH值、ORP來表征生態演替過程中優勢種群的生態位圖。

Ghosh和Poland在1971年提出了利用相分離的原理:分別控制適應于產酸發酵菌和產甲烷菌的最佳生理及生態條件,從而形成具有較高運行穩定性和處理效率的兩相厭氧生物處理系統。目前,對于兩相厭氧生物處理的微生物生態學的研究普遍受到重視,但是由于產甲烷菌具有種類少、生長繁殖慢、利用底物種類有限、對環境條件敏感等特性,使得人們長久以來認為產甲烷相是兩相厭氧處理系統中的關鍵“限速步驟”,因此大多數研究集中于產甲烷相微生物的生態學研究上。事實上產酸相不同生態條件下形成的末端發酵產物作為產甲烷細菌利用的底物,對產甲烷相乃至整個工藝的穩定運行具有至關重要的作用[1]。以往的研究表明,產甲烷相微生物對底物的轉化速率依次為乙醇>戊酸>丁酸>乙酸>丙酸,而乙酸的轉化是系統產甲烷即去除效率的“限速步驟”。從整個系統角度出發,產酸相最佳發酵類型應為乙醇型發酵[2]。因此利用連續流產酸發酵反應器,通過對限制性因子(pH、ORP)的調控,考察在人工創建生境中,微生物所遵循的群落與種群生態學演替規律,不同發酵類型的頂級群落內平衡與反饋調節的生理代謝機制,得出以pH、ORP表征的生態演替過程中優勢種群的三維實現生態位,這對于進一步闡明產酸相不同發酵類型的生態學規律,提高兩相厭氧的整體處理水平具有新的思路和理論指導意義。

1　試驗材料與方法

1.1　實驗裝置

采用沉淀區和反應區一體化、內設氣—液—固三相分離裝置的連續流攪拌槽式厭氧反應器(CSTR)作為產酸相反應器,有效容積為3.1L,通過對pH、ORP進行調控進行平行實驗;反應器外部纏繞電熱絲結合溫控儀保證內部溫度(30±1℃)的厭氧條件,實驗中控制COD負荷為8kg/m3·d,進水COD濃度為4000mg/L。具體流程見圖1所示。

1.2　實驗底物與分析方法

采用廢糖蜜為底物,并按照COD∶N∶P=800~1000∶5∶1配以少量N、P。采用標準方法分析測定COD、pH、ORP(以電極電位Eh計,mV)。液相發酵產物采用SC-7氣相色譜分析儀,按照任南琪[1](1994)建立的檢測方法進行分析。厭氧細菌的培養采用改進的Hungate技術,鑒定方法參見參考文獻[3]。

2　結果與討論

產酸發酵類型指依據酸性末端產物中揮發性脂肪酸(VFA)的分布判斷微生物的生理代謝途徑。酸性末端產物中始終占據主導地位的物質定義為相應的代謝類型,并將產酸發酵生態系統達到穩態時代謝的優勢種群定義為頂極群落。產酸相的三種發酵類型中,丁酸型發酵和丙酸型發酵分別以丁酸或丙酸為主要液相末端發酵產物,而乙醇型發酵的主要液相末端產物為乙醇和乙酸。

生態演替是生物群落的一個動態變化特性,具有定向性、可調控性、趨于穩定性。由于環境因素(因變因子:pH、ORP)、微生物內部群落及末端代謝產物組成的協調控制,產酸相微生物群落在隨環境因素定向演替的同時,由于群落的內平衡和反饋調節機制,又保持了相對的穩定性,即形成與不同發酵類型相對應的特征頂級群落生態系統,頂級群落中微生物通過種間競爭和協同作用選擇優勢種群,形成復雜的生態學決定關系[4~5](圖2)。

2.1　乙醇型頂極群落的結構模式及生態演替

產酸發酵反應器的乙醇型發酵是以H2為主要氣相產物,乙醇、乙酸為主要液相產物的發酵類型,在ORP、pH特別低的情況下,以產生乙醇的方式保證細胞內部的正常pH值,以維持機體正常產能和合成代謝,同時每產生1mol乙醇,氧化NADH的量為2mol,以此實現NAD+/NADH的耦聯,并產生1mol氫氣見表1。乙醇型發酵具有很強的穩定性,不同反應器及不同運行階段的乙醇型發酵微生物優勢菌群見表2。

2.2　丙酸型頂極群落的結構模式及生態演替

丙酸的產生和積累對厭氧生物處理系統有重要的影響,導致系統pH降低而發生“酸化”,致使產甲烷菌失活[6]。主要原因是丙酸在產甲烷相的產乙酸過程緩慢。丙酸型發酵的典型細菌丙酸桿菌屬無氫化酶,不產生氫氣。丁酸型發酵的主要限制性因素為較高的ORP和pH5.0。不同反應器及不同運行階段的丙酸型發酵的頂級群落中優勢種群見表3。

2.3　丁酸型頂極群落的結構模式及生態演替

從微生物代謝角度講,pH接近中性時細菌以合成代謝為主,數量的增殖增加了ATP的消耗量,而丁酸型發酵的單位ATP產量是3,因此被選擇。在環境中ORP較低、pH為6.0和5.0左右發生的是丁酸型發酵。而較高ORP、pH為5.0時的丙酸型發酵是由于丙酸桿菌的兼性需氧性所致。不同反應器及不同運行階段的丁酸型發酵的頂級群落中優勢種群見表4。按照Odum生態學的觀點分析,在調節pH、ORP的生態演替過程中,環境中的頂極群落受環境中生態因子的制約而呈現一定的演替過程,最終被環境條件所選擇的微生物成為優勢菌群,這是群落“進化”過程中功能由量變到質變的過程,這一過程包括以下階段:(1)各種發酵類型微生物之間復雜的種群關系通過微生物的生理代謝調節作用,與生境相適應的優勢種群得以生長繁殖;(2)同種發酵類型微生物頂極群落的內平衡與反饋調節能力;(3)不同發酵類型代謝末端產物對群落的制約、調控;(4)頂極群落中某些優勢種群(如2）反應器的擬桿菌屬)的生態位與反應器內生態條件相似,污泥馴化初期已是優勢種群,其優勢地位不易動搖。

2.4　演替過程中優勢種群的生態位

圖4所示是以ORP、pH值組成的產酸相不同發酵類型頂極群落中優勢種群的二維實現生態位圖。由圖3可見,生態因子制約了優勢種群的生態演替,在這一過程中,各種類型微生物為形成穩定的頂極群落,通原因。膜組件的材料、MBR的運行條件和活性污泥的性質決定了這些因素的影響程度。(3)通過合理的設計及優化運行條件,結合有效的反沖洗和清洗措施,能夠最大限度地控制膜污染和恢復膜通量。

微生物論文:滅菌后腹腔鏡手術器械的微生物學檢測評價

【關鍵詞】 滅菌

摘要：目的：評價可拆卸腹腔鏡器械的滅菌效果。方法：將兩種腹腔鏡器械認真徹底清洗后，用同一方法滅菌后進行細菌學檢測。結果：可拆卸腹腔鏡器械的滅菌后細菌學檢測合格率達100%，不可拆卸腹腔鏡器械的滅菌后細菌學檢測合格率達僅占87.54%。結論：可拆卸的腹腔鏡器械滅菌效果達標，為確保醫療安全，建議購買可拆卸的腹腔鏡器械。

關鍵詞：腹腔鏡器械；可拆卸；不可拆卸；滅菌；檢測

《消毒技術規范》中規定腹腔鏡器械用前必須達到滅菌水平［1］。目前市面上有兩類不同的腹腔鏡器械即不可拆卸和可拆卸的腹腔鏡手術器械。為評價兩種不同腹腔鏡手術器械的滅菌效果，在2003年7月至2004年12月期間，將不可拆卸與可拆卸腹腔鏡手術器械進行滅菌效果檢測，比較二者的滅菌效果。

1 材料和方法

1.1 材料及設備：選擇常用的腹腔鏡手術器械如抓鉗、分離鉗、鈦夾鉗、腸鉗、持針器、薄剪、鉤剪、雙極電凝等不可拆卸和可拆卸的腹腔鏡器械共659件次；滅菌器用廣州匯日醫療設備有限公司生產的WAYWIN?2000醫用滅菌器及其配機專用的消毒劑（過醋酸和水楊酸）和超聲清洗機；Elecsys 2010電化學發光儀由瑞士羅氏公司提供。VITEK-2全自動細菌鑒定系統由法國梅里埃公司提供；生物學監測滅菌效果用枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9372）；洗滌劑用美國強生公司生產的適酶洗滌劑；吹干器械用高壓氣槍；純抗原HbsAg（1.5mg/ml）由廣東省臨檢中心提供。

1.2 器械的清洗：先用流水沖凈腹腔鏡手術器械的肉眼可見污物，再將所有腹腔鏡器械用0.8%的適酶溶液超聲清洗30min。可拆卸的腹腔鏡器械在清洗前先將器械的各個關節部位全部打開，將操作桿套管、管蕊分離，使內管道及管蕊裸露。

1.3 不可拆卸腹腔鏡器械的清洗：因不可拆卸腹腔鏡器械的特殊構造，不能拆開器械的各關節及內管蕊等，所關節和內管腔等部位較難清潔。用超聲清洗器洗完后，只能靠人手用刷子、針頭或尖刀刷洗和挑去夾縫中的污物等，流動水認真仔細清洗器械的各個部位，然后用流水沖洗，再用高壓氣槍吹干。

1.4 可拆卸腹腔鏡器械的清洗：用超聲清洗器洗完后，人手用毛刷子流動水下清洗各個部位后，用高壓氣槍吹干。

1.5 器械的滅菌：將兩種腹腔鏡器械同時放入同一爐WAYWIN?2000醫用滅菌器內，按操作程序進行滅菌；每次均按要求放入枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9372）進行生物學監測。

1.6 器械滅菌后的細菌學檢測：標本采集：將滅菌后腹腔器械前端（接觸病人端）按無菌操作放入10ml無菌洗脫液內反復活動關節15次后［3］送檢，并均作陽性對照。按《消毒技術規范》醫療器械滅菌效果的監測要求進行檢測［4］。在2001年7月至2002年12月期間共滅菌了102爐次，共檢測了659份標本。

2 結果

兩類腹腔鏡手術器械的滅菌效果（見表1）；每爐的枯草桿菌黑色變種芽胞生物指示劑經檢測均符合要求。

表1 兩類腹腔鏡手術器械的滅菌后細菌學檢測結果　略

3 討論

3.1 從表可知，可拆卸的腹腔鏡器械滅菌合格率為100%。不可拆卸的腹腔鏡器械的滅菌合格率僅有87.54%，檢出的細菌中有致病性和耐藥性均強的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，可引起難愈性術后感染，不符合滅菌物品的要求（必須達到100%）［5］。兩者都未檢出病毒。由此可見，為保證腹腔鏡手術器械的滅菌效果，避免發生醫院內感染，確保醫療安全，應該選用可拆卸的腹腔鏡手術器械。

3.2 清洗徹底是保證消毒或滅菌成功的關鍵［6］。而《消毒技術規范》中要求腹腔鏡器械應達到滅菌水平。為確保滅菌效果，器械的各個部件都應便于拆卸和互換，同時強調清洗器械時，要對器械進行徹底拆卸、清洗［7］。腹腔鏡手術器械。

3.3 比普通手術器械的構造復雜、精細，有細小的內腔。不可拆卸的腹腔鏡手術器械，由于無沖洗管、無法拆開各關節及部件，較難清洗到關節部位及內腔，手術時反吸的血污較難清洗干凈，極易殘留污物和細菌。WAYWIN?2000醫用滅菌器是通過三層過濾的無菌水加上專用滅菌劑（過醋酸和水楊酸者）充分接觸而達到滅菌。但由于器械的不可拆卸，滅菌時器械的某些部位無法與滅菌劑接觸，存在盲點，而導致器械殘留或滋長細菌，存在醫療安全隱患。

3.4 可拆卸的腹腔鏡器械，可將器械的操作桿套管、管蕊及手柄等關節部位拆開裸露，清洗方便、徹底。滅菌時器械的各個部位均能與滅菌劑充分接觸，不存在盲點，這應是可拆卸腹腔鏡手術器械經細菌學檢測全部無菌生長的主要原因之一。

3.5 我國自1991年開展腹腔鏡手術，在10多年的時間里，腹腔鏡外科由于創傷小、痛苦少、恢復快等眾所周知的特點，以異常迅猛的速度得到了發展［8］，許多醫院都先后開展了腹腔鏡手術。但由于各家醫院的經濟條件不同，所購買的器械檔次也不同。為了保證腹腔鏡器械的滅菌效果，確保醫療安全，筆者建議，不管購買何種檔次的器械，應購買可拆卸的腹腔鏡手術器械，以方便清洗和保證滅菌效果，確保醫療安全。現有不可拆卸的腹腔鏡手術器械，由于價格較貴，且性能完好，只能逐步淘汰，不可能隨便丟棄。建議此類器械采用2%戊二醛浸泡10h，使用前用無菌水徹底沖洗干凈再使用。此方法滅菌效果經檢測合格率可達100%，能符合要求（另文論述），確保腹腔鏡手術器械安全使用。

微生物論文:微生物來源的具有促進纖溶作用的低分子化合物的研究進展

【摘要】 歸納了纖溶酶原的空間結構和纖溶酶原的活化在血栓溶解上的重要作用，分析了低分子化合物通過改變纖溶酶原空間結構促進血栓溶解的機理。重點敘述了到目前為止發現的complestatin,chloropeptin Ⅰ,stablabin,sarfuctin,glucosyldiacylglycerol等幾類具有促進纖溶作用的低分子天然化合物和它們各自的特性，并且敘述了這些化合物促進纖溶作用的機制。

【關鍵詞】 纖溶酶原；纖溶作用；低分了化合物

纖溶系統（纖溶酶原/纖溶酶系統）具有溶解血栓的作用，此外它還與創傷治療、組織再建、血管新生、炎癥反應、排卵、癌的形成與轉移、動脈硬化、病原菌的組織侵入等許多生理的、病理的變化過程相關［1，2］，纖維蛋白原是血液中的重要構成蛋白質，正常血漿的含量在2～4g/L，纖維蛋白原由3種線狀的糖蛋白分子所構成，蛋白質長鏈通過二硫鍵結合在一起形成分子量為34萬的纖維蛋白原大分子，以溶解狀態參與血液循環，通過血液凝固反應，在凝血酶的作用下纖維蛋白原能被轉變成不溶的纖維蛋白（血栓）沉積在血管壁上。纖溶系統的纖溶酶原和纖溶酶原激活劑通過賴氨酸結合位點與纖維蛋白相結合，在該結合部位形成的纖溶酶將纖維蛋白分解，纖溶酶原被兩種纖溶酶原激活劑（plasminogen activator,PA)尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator,uPA)和組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator,tPA)激活成具有活性的纖溶酶，該纖溶體系的活性以及纖溶酶原轉換成纖溶酶的變化過程被PA抑制劑PAL-1（plasminogen activator inhibitor 1)、α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin)所調節。

在血液凝固-纖溶體系，一些生理活性成分能夠通過（1）促進非活化狀態的纖溶酶原向活化的纖溶酶的轉化；（2）提高纖溶酶原的血栓結合活性；（3）改變纖溶酶原的空間結構使該酶原處于容易被纖溶酶原激活劑活化的狀態；（4）促進血液中微量存在的尿激酶型纖溶酶原激活劑前體（prourokinase)向尿激酶型纖溶酶原激活劑的轉化從而開始纖溶作用的爆發式血栓溶解反應，來加快纖溶酶原向纖溶酶的轉化或促進纖溶酶的纖維蛋白（血栓）酶解反應過程，血管中因病理作用生成的血栓將被溶解并進而消除血 栓癥。從天然化合物中探索針對于纖溶體系的酶原、酶的 特異性生理活性物質作為血栓癥的治療藥物將不存在生理性的出血危險性，并且會適用于慢性及早期血栓癥狀。基 于上述事實和理論基礎，利用纖溶體系的酶原［3，18］（plasminogen,prourokinase)、血栓構筑的in vitro檢索體系從微生物和海藻的代謝產物中已經發現了纖溶酶原的活性促進物質如complestatin,staplabin,plactins,surfactin和尿激酶型纖溶酶原激活劑前體的內因性活性促進物質glucosyldiacylglycerol等，這些化合物的促進纖溶作用或者是剛被發現、或者是活性低等原因，離臨床應用還需要作大量的研究。但由于低分子化合物在微血栓、慢性血栓和使用上的巨大潛力和安全性，在溶血栓藥物的研究領域，發現和研究低分子纖溶促進化合物正在成為探索新型纖溶療法藥物的重要途徑。一些研究者在探索促進纖溶作用的低分子天然化合物時，發現了一些具有促進纖溶作用的化合物，本文歸納了這些化合物的探索途徑、分離純化、特性和促進纖溶作用的機制。

1 纖溶酶原的空間結構和活化

在血液中循環的纖溶酶原（Glu1-plasminogen;Glu-Plg)具有閉合的空間結構，在血液中被纖溶酶原激活劑低效率的活化［4，5］，這種閉合型的空間結構被存在于N末端80個殘基（N-terminal peptide,NTP)中的賴氨酸殘基（Lys50或Lys60）與存在于第5個鏈回環（K5）上的氨基已糖結合位點形成分子內結合鍵所維持［5，6］，當第5個鏈回環上的氨基已糖結合位點與纖維蛋白（或細胞受體）相結合時，NTP-K5的相互作用被解除，纖溶酶原分子被轉變成開放型的結構，纖溶酶原分子在空間馳豫，從而裸露在纖維蛋白（血栓）表面的賴氨酶殘基與纖溶酶原上顯露出來的賴氨酸結合位點結合后，在空間馳豫的纖溶酶原被結合到纖維蛋白表面，纖溶酶原進一步被存在于其附近的組織型纖溶酶原激活劑（t-PA)高效率的轉變成纖溶酶。由于纖溶酶原其分子結構上的閉合狀態與開放狀態的轉化特性（圖1），在纖維蛋白（或是細胞間質）上，纖溶酶原的活性表現出是局域性的，血栓（纖維蛋白）溶解最先開始于賴氨酸殘基的周圍，其作用機理如圖2所示。另外，隨著纖溶的進行，Glu-Plg的N末端短肽被絲氨酸蛋白酶纖溶酶所切斷，Lys78-plasminogen (Lys-Plg)在纖溶酶所出現的區域產生，Lys-Plg分子由于不帶有NTP-K5分子內結合鍵，所以是開放型構造，容易活化，并且通過高親和性與纖維蛋白結合。低分子化合物ε-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)或氨甲環酸(tranexamin acid)結合在K5鏈回環的賴氨酸結合位點，使Glu-Plg成開放性構型，因此，賴氨酸類似物顯著地促進Glu-Plg的活性化，但與此相對，賴氨酸類似物阻礙了纖溶反應（纖維蛋白的分解），這是由于介于纖溶酶原鏈回環上的賴氨酸結合位點的Glu-Plg-纖維蛋白復合物的形成被阻抑了。在纖維蛋白溶解反應的局域性和纖溶反應的高效性上，血液中的Glu-Plg與纖維蛋白的結合以及由此帶來的空間結構的變化發揮著重要的作用。纖溶酶原是由791個氨基酸構成的單鏈糖蛋白，構成糖約占分子量的2%。從N末端開始順次分為N末端短肽結構域（N-terminal peptide,NTP)、5個鏈回環結構域（kringle 1,kringle 2,kringle 3,kringle 4,kringle 5)、酶活性中心結構域和C末端氨基酸。酶活性中心在His603-Asp645-Ser740,uPA或tPA限定分解Arg561-Val562肽鍵（圖中的虛心箭頭位置）成雙鏈的纖溶酶，PA（plasminogen activator)切斷Arg561-Val562肽鍵后，N端的A鏈（或重鏈）C端的B鏈（或輕鏈）。

圖中圓圈和其中的字母表示具體的氨基酸及其位置：數字表示從N末端起始的氨基酸序列：實心箭頭表示彈性蛋白酶（elastase）、胃蛋白酶（pepsin)、鮮黃蛋白酶V8(aureus V8 protease)的水解位點，共6個；虛心箭頭表示纖溶酶原激活劑的作用位點；短橫線表示分子內二硫鍵，共23個；短折線表示糖鏈；實心圓圈和其中的字母表示活性中心氨基酸及其位置。

Glu-Plg由NTP、5個鏈回環結構域（K1～K5）、絲氨酸蛋白酶活性中心結構域構成，在K1、K2、K4、K5存在賴氨酸結合位點，K5的賴氨酸結合位點由于也能識別氨基已糖，所以又稱作氨基已糖結合位點，能結合肽鏈中的賴氨酸。Glu-Plg分子的NTP Lys50(或Lys62)在K5的AH位點上形成分子內結合鏈，維持著緊密的空間結構，對活化作用顯示出抵抗性。通過K5與纖維蛋白或細胞受體的結合，以及纖溶酶切斷NTP，都會使纖溶酶原的空間結構發生馳豫，從而感受到PA的活性化。

2 促進纖溶作用的化合物

到目前為止，主要的纖溶促進化合物（圖3）的特性被歸納在表1，這些化合物的探索途徑、分離純化和纖溶促進機制分述如下。 圖3 促進纖溶作用的低分子天然化合物 表1 具有纖溶促進作用化合物的特性注：-沒有實驗數據；*含有不同于纖溶酶原作用特點的特征

2.1 complestatin和chloropeptin 1 以纖溶酶原和纖溶酶原受體構成in vitro檢索體系，用于探索促進纖溶酶原向受體結合的低分子天然化合物。認為促進纖溶酶原向纖溶酶原受體結合的化合物也會促進纖溶酶原和纖維蛋白（血栓）的結合，進而促進血栓的溶解。以U937細胞作為纖溶酶原受體的供體，使用人纖溶酶原構成了纖溶促進化合物的檢索體系，在對約5000株微生物的代謝產物進行篩選的基礎上，從鏈霉菌屬（Streptomyces)的一株代謝產物中發現了低分子化合物圖3）complestatin和chloropeptin 1［7,8］促進了纖溶酶原向U937纖溶酶原受體的結合。該化合物是從土壤的分離菌株中分離純化的，將活化培養的種子液接種到由可溶性淀粉3%、肉膏1%、混合溶液1.5%、玉米浸出汁2%和消泡劑CB442 0.01%構成的液體培養基（pH7.0）中，在25℃、310 rpm的條件下連續培養3天，收獲的菌絲用70%丙酮溶液提取，提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物經丙酮-甲醇（5：1）硅膠層析后，活性化合物被移動相為含0.2%三氟醋酸的45%乙氰水溶液的高壓液相色譜柱（Inertsil PREP-ODS)所精制。

chloropeptin 1是complestatin (c61H45N7O15Cl6,MW1325)的異構體，只在苯甘氨酸-色氨酸殘基的結合位置不同。complestatin和chloropeptin 1在0.5～10μM的添加濃度下，使Glu-Plg向U937細胞的結合增加了2～5倍，這些化合物由于也增加了Glu-Plg和纖維蛋白的結合，所以可以認為這些化合物是作用于纖溶酶原的，另外，這些化合物的作用能被ε-氨基已酸所阻礙，并且從化合物的作用特點能認為纖溶酶原和U937細胞沒有形成新的結合方式，是complestatin和chloropeptin 1促進了纖溶酶原和U937細胞介于賴氨酸結合位點結合的增加。伴隨著纖溶酶原向細胞或纖維蛋白結合的增加，細胞或纖維蛋白上纖溶酶的生成也增加了。在使用全血形成血栓的纖溶實驗上，確認了兩種化合物介于tPA促進了血栓的溶解［8］，這之后，又確認了這些化合物帶來了Glu-Plg空間結構的變化以及促進了介于uPA的Glu-Plg的活性化，從Glu-Plg空間結構的變化也能說明Glu-Plg向U937細胞結合的增加。另外，這些化合物不能直接促進纖溶酶以及纖溶酶原激活劑的酰胺分解活性。

2.2 萜類化合物（staplabin,SMTPs: Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol) 在探索Glu-Plg和纖維蛋白結合的促進化合物上，利用纖溶酶原-尿激酶前體-S2251的in vitro篩選體系，從微生物的培養液發現了新型的萜類代謝產物［9］，這之后，又發現了8種新型同類化合物［10～12］。Staplabin（圖3）具有顯著的促進纖溶作用，該化合物分離于土壤微生物Stachybotrys Microspora的一個菌株。將經過種子培養的菌株接種到1L培養液含30g葡萄糖、10g脫脂豆粉、3g肉膏、3g酵母粉、3g蛋白粉、0.5g磷酸二氫鉀、0.5g七水硫酸鎂和0.1g消泡劑CB442的培養基中，在25℃、180rpm用500ml三角瓶連續培養3～5天，培養液離心后，上清液用等量的2-丁酸抽提，抽提物用二氯甲烷和甲醇展開于硅膠層析柱，活性成分被Inertsil SIL-ODS精制，移動相是流速為9.9ml/min的乙烷和乙醇（98：2）的混合溶液。

300～500μM的staplabin使Glu-Plg和Lys-Plg與纖維蛋白的結合增加了，這種增加依賴于Glu-Plg和Lys-Plg上的賴氨酸結合位點，并且在纖溶酶原激活劑存在下，Glu-Plg和Lys-Plg的活化被促進了，所以體現出提高了纖溶酶的分解活性［13］，在使用分子排除層析的實驗上由于該化合物部分地縮短了Glu-Plg和Lys-Plg的溶出時間，所以被認為該化合物使這些分子馳豫。纖溶酶原活性化的促進作用在ε-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)和纖溶酶原斷片存在的情況下也能觀察到，所以能認為staplabin帶來的構型的變化和complestatin這些化合物帶來的變化是不同的［13］，這種結果，也被staplabin的活性化促進作用能在mini-Plg上觀察到的事實所支持。SMTPs Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol）（圖3）也顯示出同樣的作用，但是SMTP-6、SMTP-7、SMTP-8與staplabin相比活性增加了3～10倍。

2.3 環肽化合物 在血漿存在下，利用U937細胞，探索促進125I-纖維蛋白分解的促進物質時，發現了4種新型物質plactins［14］（圖3）。

在和50種合成誘導物比較之后，發現plactins的D-Arg(或D-Lys)殘基和4個疏水殘基的立體配置構型是顯示活性所必需的結構［15］。20～50μM的plactin介于血漿中的因子將細胞表面的單鏈的尿激酶前體轉變成活化型的雙鏈結構，而開始了纖溶反應。該活化機制比較復雜，介于多個因子的多條途徑引起了促進纖溶作用。將Plactin 2.5～5mg/kg投于肺栓塞小鼠，小鼠栓塞肺的纖溶活性被促進了2～3倍。在uPA存在下，40～60μM的plactin使Glu-Plg的活化被提高了10倍，并且plactins使Glu-Plg的內部熒光增加了5%，但plactins對Lys-Plg的活性沒有影響。與前述的化合物不同，plactin沒有增加Glu-Plg與纖維蛋白的結合。該化合物在血漿/U937細胞體系將纖維蛋白的分解提高了3～4倍，但在Glu-Plg/U937細胞體系和Glu-Plg/uPA體系，沒有促進纖維蛋白的分解，這暗示著plactin的促進纖溶作用依賴于Glu-Plg以外的通路。

2.4 脂蛋白（surfactin) 在尿激酶前體和纖溶酶原構成的反應體系中，尿激酶前體的內因性活性作用帶來了Glu-Plg的活化，從纖溶酶原轉化生成的纖溶酶將進一步把尿激酶前體轉變成具有充分活性的尿激酶，利用該正反饋體系，從細菌的代謝產物發現了尿激酶前體-纖溶酶原反應體系中促進纖溶作用的物質surfactin類化合物，該類化合物是一種脂蛋白［16］（圖3）。

從土壤分離到的一株枯草芽孢桿菌的代謝產物被檢索出來具有促進纖溶作用，將該菌株用普通細菌培養基在28℃、180rpm連續培養5天后，將培養液用2-丁醇提取后，提取物用乙氰-0.1%乙酸（60：40）展開于高壓液相色譜柱Inertsil PREP-ODS上，活性成分經濃縮和凍結干燥后得到了脂蛋白surfactin。

3～10μM的surfactin C使纖溶酶原和尿激酶前體的轉換被提高了3～4倍，這種促進作用是由于surfactin C促進了尿激酶引起的Glu-Plg的活化。Surfactin C也促進了Lys-Plg的活化，但surfactin C不影響mini-Plg的活化，在ε-氨基乙酸存在下也不影響Glu-Plg的活化，這個結果暗示著surfactin C作用于纖溶酶原鏈回環的K1、K2、K3、K4中的某個或某幾個結構域，因為ε-氨基已酸作用于纖溶酶原鏈回環的K5結構域，而不影響纖溶酶原鏈回環的K1、K2、K3、K4結構域。surfactin C使Glu-Plg的內部熒光增加了7.4%，有分子排除層析實驗上使Glu-Plg的溶出時間縮短，從這些結果上能判斷Glu-Plg的空間結構被馳豫了。該化合物促進了Glu-Plg和纖維蛋白的結合，在pro-uPA/Glu-Plg,uPA/Glu-Plg,uPA/血漿體系促進了纖溶作用。該化合物（1mg/kg)和pro-uPA投于肺栓塞大白鼠，125I標記的大白鼠肺栓塞的溶解速度與對照相比被提高了3倍。

2.5 脂類化合物 利用纖溶酶原和尿激酶前體的相互活化作用，探討了具有促進纖溶作用的天然化合物，對700多種植物提取液進行篩選的結果，從海藻中發現了一種稀有化合物α-D-葡萄糖甘油二酯［17］（圖3）的促進纖溶作用。將干燥的褐藻添加到三氯甲烷和甲醇的混合有機溶劑（HCCl3：CH3OH=2：1）中，用組織搗碎機充分破碎，過濾之后回收濾液，針對殘渣重復一次上述的提取過程，再用提高了溶劑極性的混合液（HCCl3：CH3OH=1：2）提取殘渣中的可溶性物質。把三次提取的濾液混合，經減壓濃縮和真空干燥，從褐藻中得到了粗提取物，該粗提物經3次柱層析后得到了精制的生物活性物質α-D-葡萄糖甘油二酯。

相當低濃度的葡萄糖甘油二酯（0.66μM)促進了纖溶酶原和尿激酶前體的相互活化作用，而半乳糖甘油二酯在20倍于α-D-葡萄糖甘油二酯的濃度下，仍然不能促進這種纖溶酶原和尿激酶前體的相互活化作用。從這兩種結構相似的中性甘油糖脂質的不同作用上，能夠推測α-D-葡萄糖甘油二酯的促進纖溶作用不是這一類化合物的共同特性。在高濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑存在、纖溶酶原和尿激酶前體相互活化、尿激酶前體不發生活性化開裂的反應體系中，α-D-葡萄糖甘油二酯促進了纖溶酶原的活性化開裂，由此說明α-D-葡萄糖甘油二酯作用于該體系中的尿激酶前體，提高了尿激酶前體的內因性尿激酶型纖溶酶原激活劑的作用。與此相一致，纖溶酶原/尿激酶前體相互活化反應體系的另外兩個反應，既纖溶酶引起的尿激酶前體的活化反應和尿激酶型纖溶酶原激活劑引起的纖溶酶原的活化反應，α-D-葡萄糖甘油二酯對這兩個反應的影響是相當小的。進一步的研究發現，葡萄糖甘油二酯帶來了尿激酶前體內部熒光的有意義增加以及它不影響纖溶酶原和尿激酶型纖溶酶原活化因子的內部熒光的變化。由這個結果能夠推測葡萄糖甘油二酯帶來了尿激酶前體空間結構的變化，并且能認為尿激酶前體的這個空間結構的變化與尿激酶前體的內因性纖溶酶原激活劑的作用有關。首次發現了提高尿激酶前體的內因性活性的天然生理活性化合物。

3 討論

到目前為止，作為酶抑制劑的天然化合物是合成化合物已經知道的很多，但與此相對，如果除去輔酶、金屬鹽類和酶原保護劑等物質，作為酶活化劑的物質的數量是相當少的。上述所敘述的化合物不是作用于酶而是作用于酶的前體-酶原，這些化合物所以能夠被確定為具有活性作用，得益于纖溶酶原分子的獨特結構。當機體受到內在或外在的刺激，凝固-纖溶系統迅速對應的必要性被通過蛋白質空間結構的變化（與酶的活化有關）體現出來，這被認為是機體進化的一個方面。纖溶酶原是這種變化過程的一個典型，發現的這些具有促進纖溶作用的化合物使纖溶酶原的空間結構發生微妙的變化從而促進了纖溶作用。從以上的這些事實還能夠進一步推測纖溶因子如纖溶酶、尿激酶、尿激酶前體的活性化合物也會促進血栓纖維蛋白的溶解，并且纖溶系統抑制因子的抑制化合物也會促進血栓纖維蛋白的溶解。

溶血鏈球菌產生的鏈激酶等細菌的代謝產物和纖溶系統的關系從很早以前就知道了，最近又從侵染性的多種病原菌中發現了纖溶酶原的受體［2］，這些受體被認為與病原性細菌的侵入和組織侵入有關。與這些受體蛋白質相比較，上述敘述的化合物是低分子化合物，這些低分子化合物來自于細菌、放線菌、霉菌和海洋生物，作用于纖溶酶原或是尿激酶前體。產生這些化合物的生產菌和高等動物的關系如何？雖然目前的材料還不充分，但這些化合物的存在也讓研究者能進一步探索這些化合物在病原菌侵染、組織纖溶、癌細胞游走和血栓疾病治療上的巨大價值。

被應用于纖溶療法上的酶或高分子蛋白如尿激酶、tPA等，主要是應用于心肌梗塞等重度血栓疾患的治療上，它會帶來全身出血的重大危險性，與此相對應，作用于纖溶酶原和尿激酶前體的低分子化合物會使生理的纖溶反應平穩的進行，特別適用于慢性疾患的治療以及血栓疾病的前期，這些化合物正被人們期待著能成為安全、高效的血栓治療藥物。

微生物論文:微生物技術在城市生活垃圾處理中的應用

摘要：本文結合堆肥化、衛生填埋兩種現行的城市生活垃圾處理工藝，主要介紹了城市生活垃圾生物處理過程中的微生物種群，以及通過分析開發出的新的微生物技術，指出了應用于城市生活垃圾處理的高效的微生物技術的研究方向。

關鍵詞：城市生活垃圾 微生物 強化微生物處理技術 基因工程

隨著城市化進程在全球范圍的加速，城市化帶來的環境污染和人類聚居狀況惡化等問題，已成為世界各國共同關心的問題。城市生活垃圾（Municipal solid waste, 簡稱MSW）是在城市日常生活及為城市生活提供服務的活動中產生的固體廢棄物，是城市環境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾處理處置的方法主要包括衛生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚燒(Incineration)三種，其中前兩種處理方式均屬于生物處理技術。具體來說，MSW生物處理技術就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制條件下，進行一系列的生物化學反應，使得MSW中的不穩定的有機物代謝后釋放能量或轉化為新的細胞物質，從而MSW逐步達穩定化的一個生化過程。

1. 城市生活垃圾生物處理中主要的微生物

MSW生物處理技術主要包括好氧和厭氧生物處理。好氧生物處理如：好氧堆肥、生物反應器填埋等，其工藝中的微生物主要有細菌、放線菌、真菌等微生物種群。厭氧生物處理，如：厭氧消化、厭氧填埋等，其工藝中的微生物又稱“瘤胃微生物”，主要有水解細菌、產氫產乙酸菌群和產甲烷菌群等。

1.1 城市生活垃圾好氧生物處理中的微生物

1.1.1 細菌

在MSW好氧生物降解過程中，細菌憑借強大的比表面積，可以快速將可溶性底物吸收到細胞中，進行胞內代謝。總的來說，其數量要比放線菌和真菌多得多。當然，在不同的環境中分離的細菌在分類學上具有多樣性，主要有假單胞菌屬（pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（klebsiella）以及芽孢桿菌屬（bacillus）的細菌[1]。在堆肥過程中，細菌總數的變化趨勢是高-低-高。堆肥初期，有機廢物中攜帶有的大量細菌分解有機物質釋放能量，使堆體溫度上升，此時，常溫細菌受到抑制，嗜溫細菌活躍；當堆溫升至高溫階段，只有少量的嗜熱細菌可以活動；高溫期過后，隨著有機成分的減少，堆體溫度降低，嗜溫及常溫細菌又開始活躍，使細菌總數上升。整個好氧降解過程中，嗜溫細菌是堆肥系統中最主要的微生物。

1.1.2 放線菌

放線菌具有多細胞菌絲，可以分解一些纖維素,并溶解木質素。它比真菌能夠忍受更高的溫度和pH值,在垃圾生物降解的高溫階段是分解木質纖維素的優勢菌群。研究表明，諾卡氏菌（nocardia）、鏈霉菌（streptomyces）、高溫放線菌（thermoactinomyces）和單孢子菌（micromonospora）等在MSW好氧堆肥中占優勢[1]。

1.1.3 真菌

在MSW生物降解過程中，真菌對垃圾有機成分的分解和穩定化起著重要的作用。真菌不僅能分泌胞外酶，水解有機物質，而且由于其菌絲的機械穿插作用，還對物料起一定的物理破壞作用，促進生化反應。溫度是影響真菌生長的重要因素之一，堆肥過程中隨著溫度的升高,真菌的菌落數開始減少,在64℃左右,嗜熱性真菌幾乎全部消失。當溫度下降到60℃以下時,嗜溫性真菌和嗜熱性真菌又都會重新出現在堆肥中[2]。

1.2 厭氧生物處理微生物

MSW的厭氧生物處理依次分為水解、產氫產酸和產甲烷三個階段，每個階段各有其獨特的微生物類群起生物降解作用。

1.2.1 水解細菌

水解階段水解細菌利用胞外酶對有機物進行體外酶解，使固體物質變成可溶于水的物質，然后細胞將其吸收，水解成不同產物，該階段起作用的細菌為水解細菌。Hungate分離出了以下幾種水解菌：（1）產琥珀酸擬桿菌屬,（2）湖生(lochheadii)芽孢菌屬,（3）柱孢梭菌屬,（4）生黃瘤胃球菌,（5）白色瘤胃球菌落,（6）溶纖維丁酸弧菌。同時還分離出纖維酶B—1,4—葡聚糖酶,外B—1,4—葡聚糖酶和纖維素二糖酶[3]。

1.2.2 產氫產乙酸菌群

產氫產乙酸菌群是將第一階段發酵產物如丙酸等三碳以上有機酸、長鏈脂肪酸和醇類等氧化分解成乙酸和分子氫。在衛生填埋場中已分離出產氫產乙酸菌布氏甲烷桿菌屬和G株布氏甲烷桿菌屬等[3]。

1.2.3 產甲烷菌群

甲烷菌利用H2/CO2、醋酸和甲醇甲酸等C類化合物為基質，將其轉化為甲烷。在衛生填埋場中,產甲烷菌群分桿狀菌、球狀菌和八疊球菌三類。桿狀產甲烷菌通常呈彎曲、鏈狀或絲狀,此類細菌有史密斯甲烷短桿菌屬、甲酸甲烷桿菌屬、巴氏甲烷桿菌屬、反芻甲烷短桿菌屬、史密斯甲烷桿菌屬、嗜熱自養甲烷桿菌等；球狀產甲烷細菌直徑為0.3～5微米,球形細胞呈正圓形或橢圓形,成對排列成鏈狀。此類細菌有巴氏甲烷八疊球菌、范尼氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、馬氏產甲烷球菌、海生產甲烷球菌及嗜熱無機營養甲烷球菌等。八疊球狀產甲烷菌,其細胞繁殖成規則、大小一致的類似砂粒的堆積物,有227巴氏甲烷八疊球菌、巴氏甲烷八疊球菌、嗜熱甲烷八疊球菌等[3]。

2. 微生物技術在MSW處理過程中的應用

MSW的生物處理主要是利用微生物在一定控制條件下，使有機物發生生物化學降解，形成一種穩定的化合物的過程。因此，微生物對垃圾中有機物降解的快慢、對有機成分降解的程度直接決定著處理周期的長短和處理效果的好壞，在MSW處理過程中起著決定性的作用。故MSW生物處理的優劣取決于微生物自身的結構、所處環境下的代謝狀況。目前有很多學者在此方面做出了很大的努力，通過分析某種處理環境下微生物的特性、采用多種方式改變工藝中微生物的數量，質量等，開發出了多種MSW生物處理技術，如：強化微生物（純種分離、強化接種、添加微生物菌劑、微生物固定化）以及基因誘變等技術。

2.1 強化微生物處理技術

強化微生物處理技術是從改變工藝中單位反應器空間內微生物的質量或數量的角度來增強MSW的降解率，從而提高處理效率，縮短處理周期。

2.1.1 純種分離

自然界中的微生物總是雜居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存著多種微生物。為了提高工藝中某種有效微生物的質量（純度），提高處理效率，必須進行微生物的純種分離技術。常見的純種微生物的分離方法有平板劃線分離、液體稀釋法分離、利用選擇培養基進行分離以及菌絲尖端切割分離[4]。

（1） 平板劃線分離

將已經熔化的培養基倒入培養皿中制成平板，用接種環沾取少量待分離的材料，在培養基表面平行或分區劃線(圖1)，然后，將培養皿放入恒溫箱里培養。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數逐漸減少，最后可能形成純種的單個菌落。

圖1 幾種劃線方法示意圖

（2） 液體稀釋法

將待分離的樣品經過大量稀釋后，取稀釋液均勻地涂布在培養皿中的培養基表面，培養后就可能得到單個菌落。

（3） 利用選擇培養基進行分離

不同的微生物對不同的試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特點可配制出適合某種微生物生長而限制其他微生物生長的選擇培養基。用這種培養基來培養微生物就可以達到純種分離的目的。

（4） 菌絲尖端切割

這種方法適于絲狀真菌。用無菌的解剖刀切取位于菌落邊緣的菌絲的尖端，將它們移到合適的培養基上培養后，就能得到新菌落。

2.1.2 強化接種處理技術

純種分離后還要將微生物接種到垃圾中進行生物處理，但由于接種微生物的生存環境發生了變化，故在微生物適應周圍環境前，處理效率達不到理想的效果，因而直接在垃圾中進行微生物接種的處理效果則應好于微生物純種分離后再接種的處理效果。直接在垃圾中進行微生物接種可采用多種方式，如：垃圾滲濾液循環、加入一定比例的垃圾腐熟物等。

微生物對垃圾的降解是在多種微生物的協同作用下完成，在適宜的條件下，微生物協同作用能力的大小取決于微生物種群的大小與結構的穩定性。一般說來，生物的種群越大，其自動調控能力越好，適應性就越強，結構越穩定。經垃圾滲濾液循環或向待處理的新鮮垃圾中加入一定比例的垃圾腐熟物進行強化接種培養后，微生物的種群擴大，且循環次數越多，微生物的數量和種群就越大，這樣就會更有利于對垃圾的降解。

2.1.3 添加微生物菌劑

研究表明,單一的細菌、真菌、放線菌群體,無論其活性多高,在加快垃圾生物降解進程中的作用都比不上復合微生物菌群的共同作用[5]。微生物菌劑是采用分離、篩選的有效微生物，配合一定的處理工藝和設備，通過合理地調配各種有效微生物的含量，進行篩選、培育MSW生物處理的高效復合微生物菌劑，進而來調節菌群結構、提高微生物降解活性，提高微生物降解有機成分的效率。復合微生物菌群中既有分解性細菌，又有合成性細菌；既有纖維素分解菌、真菌，又有放線菌。向工藝中添加復合微生物菌劑，不僅增加了工藝中微生物初始濃度，而且改善了工藝中微生物的種群結構。作為多種細菌共存的一種生物群落，依靠相互間共生增殖及協同作用，代謝出抗氧化物質，生成穩定而復雜的生態系統，使得整個生物降解過程中微生物數量保持相對穩定，處理效果較佳[6]。

2.1.4 固定化技術

固定化微生物技術是將微生物固定在載體上，使其高密度密集并保持其生物功能，在適宜的條件下還可增殖，以滿足處理工藝的要求[7]；實質上是從增加單位反應器內微生物數量的角度來提高微生物的活性，使得細胞密度高，微生物流失少、不需分離，就能純化和保存高效菌株等優勢，反應速度快，運行穩定、可靠，從而節約運行成本，提高MSW的處理效率。固定化微生物技術目前國內外還沒有一個統一的分類標準，方法也多種多樣，主要有載體結合固定化（吸附法）、交聯固定化、包埋固定化和共價結合法，各種固定化方法和載體都各有特點,見表1。其中，微生物細胞的固定化方法以包埋法和吸附法最為常用。包埋法是將微生物封閉在天然高分子多糖類或合成高分子凝膠的網絡中，從而使微生物固定化；其特點是可以將固定化微生物制成各種形狀(球狀、塊狀、圓柱狀、膜狀、布狀、管狀等)，但包埋法制得的固定化微生物對傳質有一定的影響。吸附法是將微生物細胞附著于固體載體上，微生物細胞與載體之間不起化學反應，并且具有操作簡單、固定化條件溫和、細胞活性損失小、載體可以反復使用等優點，所以被廣泛應用和深入研究[8]。

微生物論文:論土壤微生物的宏基因組學及其研究進展

論文關鍵詞 土壤宏基因組學；研究進展；局限性

論文摘要 土壤宏基因組學技術是近來發展比較迅速的一種新方法，是研究土壤微生物生態學的基礎，也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。介紹了土壤宏基因文庫的構建、篩選及土壤宏基因組研究現狀和這一技術的局限性。

宏基因組學源于20世紀70年代土壤微生物基因組DNA的直接提取技術的實現，隨著微生物學和生物技術的不斷發展，Handelsman于1998年提出了宏基因組學的概念[1]。宏基因組學又叫環境基因組學（Environmental Genomics）或群體基因組學（Community Genomics），定義為利用現代基因組技術直接研究自然狀態環境中的有機體群落，而不需要分離、培養單一種類的微生物。生物學和化學的結合孕育了宏基因組學的誕生，而宏基因組學的發展需要最大限度的利用現代生物技術和實用篩選技術。

土壤宏基因組學技術是近來發展比較迅速的一種新方法[2]，這種方法從土壤環境樣品中直接提取微生物基因組DNA（宏基因組）并克隆于不同載體，再將重組載體轉移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫；同時結合不同的篩選技術，從基因文庫中篩選新基因或新的生物活性物質。應用這些免培養的新方法和新技術，可以繞過微生物菌種分離培養這一技術難關，直接在基因水平上研究、開發和利用無法培養的微生物資源；有利于揭示不可培養微生物的基因多樣性，為農業、醫藥和環境的可持續發展提供豐富的資源。

1土壤宏基因文庫的構建

關于土壤宏基因組學技術的構建已有許多研究報道[3]，文庫的構建需要足夠高質量的DNA，由于土壤微生物往往會與土壤其他組分緊密結合，這就增加了提取土壤DNA的難度[4]。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，使其釋放DNA，繼而抽提純化；間接提取法是首先去除土壤等雜質，通過不同的離心速度從土壤中分離出細胞，然后對細胞進行抽提。直接提取法提取的DN段較小（1~50kb），提取率高，操作簡單；間接提取法提取的片斷較大（20~500kb），純度高，但操作繁瑣，有些微生物在分離過程中會丟失。

根據插入片斷大小，可以把基因文庫分成2類：質粒載體的小片段插入（小于15kb）和柯斯質粒（15~40kb）或BAC（細菌人工染色體）（超過40kb）載體的大片段插入。大腸桿菌（Escherichia coli）是表達土壤細菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭載體或BAC文庫可將大腸桿菌包含的文庫信息轉移至其他宿主如鏈霉菌或假單胞菌[5]。

載體系統的選擇取決于所提取土壤DNA的質量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數、使用的宿主以及篩選方法等。如對腐殖質含量較高或剪切較嚴重的DNA樣品適宜構建質粒文庫，小片段的文庫適用于篩選新的與代謝相關的單基因或小操縱子；而對于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則需要構建大片段和大容量的載體文庫。Rondon直接把環境DNA克隆到低拷貝BAC載體，以大腸桿菌作為宿主構建了含100Mbp 的小文庫（SL1），

并從這個文庫中檢測到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。

2土壤宏基因組文庫的篩選

宏基因文庫的篩選主要有功能驅動篩選、化合物結構水平的篩選、序列驅動篩選，底物誘導基因表達篩選。功能驅動篩選是根據重組克隆產生的新活性進行篩選，在工業上有很多重要的酶就是用這種方法發現的。其主要缺點是要在寄主中進行功能表達，造成篩選工作量大，效率低。化合物結構水平的篩選是根據不同結構的物質在色譜中有不同的峰值，通過比較轉入和未轉入外源基因的宿主細胞或發酵液抽提物的色譜圖篩選產生新結構化合物的克隆子。此方法工作量大，費用高。序列驅動篩選是不依賴重組基因在宿主中表達來篩選，而是根據已知功能的基因序列設計探針或PCR引物，通過雜交進行篩選具有目標序列的克隆子。底物誘導基因表達篩選是利用底物誘導克隆子分解代謝基因進行篩選，這種方法已經成功的從宏基因中篩選出芳烴化合物誘導的基因。國內外的資料顯示這4種篩選方法可以篩選到所需要的物質，但篩選效率低，費用高。

3土壤宏基因組研究現狀

利用宏基因組學的技術，科研人員篩選到了許多功能基因，加拿大TerraGen Discover公司最先在以鏈霉菌為宿主的宏基因組文庫中篩選到了具有抗菌活性的5種新的小分子物質TerragineA、B、C、D、E[5]；Courtois等利用柯斯載體構建了含5 000個克隆子的環境基因組文庫，采用PCR 序列分析的方法，篩選出編碼聚酮合成酶的新基因，同時采用HPLC技術發現了脂肪二烯醇中2種新的化合物，兩者互為同分異構體；Yun等選用pUC19為克隆載體構建大腸桿菌基因組文庫，利用活性篩選方法，從30 000個重組子中篩選出1個含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。

2005年，LimHK等以枯草芽孢桿菌為宿主，建立了森林土壤的宏基因組文庫，篩選到2個具有抗菌活性的克隆，對其結構進行分析，得出其中一個為產紅色色素的靛玉紅，另一個為產藍色色素的靛藍，是靛玉紅的異構體。2006年，Voget S等首次研究了從土壤宏基因組文庫中篩選到的一種纖維素酶的性質，證實了其具有較廣的pH值和溫度適應范圍，并且在較高的鹽度時也具有活性，具有工業應用價值。

4土壤宏基因組學的技術局限性

總DNA提取技術尚存在一定的限制，土壤環境中，由于微生物與土壤顆粒緊密結合的特性以及腐殖酸等抑制性物質存在等原因，從中難以獲得適于構建宏基因組文庫的高分子量DNA。Bertrand等采用間接提取法，通過Nycodenz梯度離心，所回收的土壤DN段大小己能達到400kbp，但至今基于原位裂解獲得>100kbp土壤DNA的提取技術尚未突破，運用原位裂解法構建更大片段環境宏基因組文庫（現有的土壤宏基因組文庫中，平均插人片段最大為44.5kb）仍是一個難點。不可避免地，環境宏基因組文庫所包含微生物基因組信息的偏差將直接導致“基因遺漏”現象發生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，卻在測序量高達1.6Gbp的馬尾藻海水宏基因組文庫中被遺漏，表明僅運用宏基因組學技術同樣會忽略部分的微生物資源。

陽性克隆篩選頻率低是宏基因組學的另一個瓶頸所在，運用經典的功能篩選方式，往往是在數千個，甚至數百萬個重組克隆子中才能檢測到有用的活性克隆，造成此局面一個重要的原因是外源基因的異源表達水平低下。目前根據核酸序列相似性及基因保守區設計探針或引物的雜交、PCR篩選方法，從文庫中發現新基因的比率尚不到已知基因的40%。

環境微生物宏基因組研究能讓我們發現存在于不可培養微生物中的一些重要的生理過程。許多實驗室已經開始努力從不可培養土壤生物的基因組序列中去獲得重要的基因，特別是從Acidobacterium組中，因為它是土壤中最常見的細菌。這些數據提供了關于這些生物在土壤中扮演角色的線索。隨著足夠序列信息的獲得，這些生物的代謝途徑將被構建出來，引導我們采取有效的策略去培養這些生物。這些數據也將準許我們構建包含所有已知開放閱讀框的微生物芯片，來確定這些基因在時間和空間上的表達狀況。

盡管宏基因組技術本身還存在著一些局限性，但它為土壤微生物的研究提供了一種有效的研究策略，尤其是對于99％以上不能獲得純培養的土壤微生物來說，宏基因組學不僅是研究土壤微生物生態學的堅實基礎，更是我們獲得土壤中各種基因資源的一個有效手段。

微生物論文:硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法的建立

【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法。方法 測定硝酸咪康唑搽劑對大腸埃希菌等5種試驗菌的回收率，對2個控制菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌）的檢查方法進行驗證。結果 用薄膜過濾法和0.1%吐溫80-ph7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑檢查本品的細菌總數、真菌及酵母菌計數，其試驗菌回收率均達到70%以上。同樣用該方法檢查本品的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，其試驗組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應。結論 用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80-ph7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑可以消除硝酸咪康唑搽劑在試驗條件下的抑菌作用，從而順利檢出該品種所污染的各種微生物。

【關鍵詞】 硝酸咪康唑搽劑；微生物限度檢查；方法學驗證

微生物限度檢查法是檢查非規定制劑及原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項目包括細菌數、真菌數、酵母菌數及控制菌檢查［1］。但具有抑菌成分的藥品由于其抑菌活性的干擾，常規檢查結果不能真實地反映出藥品中污染微生物的情況，必須先消除供試品中的抑菌活性，再根據《中國藥典》規定的方法進行檢查，并必須對所采取的檢查方法進行驗證，以確認抑菌活性的消除和檢查方法的可靠性。具有抑菌作用的藥品，每個品種抑菌效果不同，因此適合各個品種的微生物限度檢查法也不同。

作者曾用常規法、培養基稀釋法及薄膜過濾法（用ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗）對硝酸咪康唑搽劑進行微生物限度檢查，結果均不能達到藥典要求。吐溫80是親水性表面活性劑，具有增溶作用，因此本文選擇用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液做沖洗劑檢查該藥品的細菌、真菌、酵母菌數和控制菌，結果滿意，可為同類藥品的微生物限度檢查法提供科學依據。

1材料

1.1菌種大腸埃希菌(escherichia coli)［cmcc(b) 44 102］, 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［cmcc(b) 26 003］, 枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)［cmcc（b）63 501］, 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［cmcc(b) 26 003］，銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）［cmcc(b)10 104］白色念珠菌(candida albicans)［cmcc(f) 980011］, 黑曲霉(asperg illus niger)［cmcc(f) 98003］，由廣東生物研究所提供，菌種代數均為第3代。

1.2培養基及試劑ph7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液、營養肉湯、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、虎紅培養基、膽鹽乳糖培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、二鹽酸二甲基對苯二胺試劑、pdp瓊脂培養基、三氯甲烷、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基和革蘭氏染色劑。

1.3樣品硝酸咪康唑搽劑，阿特維斯（佛山）制藥有限公司，批號：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亞砜。

2方法與結果

2.1菌液制備［1］

2.1.1取經37 ℃ 培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與大腸埃希菌的肉湯培養物1 ml，加入9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 ml中含菌數50～100 cfu的菌懸液，做活菌計數。

2.1.2取經25 ℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物1 ml，加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 ml中含菌數50～100 cfu的菌懸液，做活菌計數。

2.1.3接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7 d，加入3～5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數50～100 cfu的孢子懸液，做活菌計數。

2.2供試液的制備［2］取本品10 ml，加ph7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，作為1∶10的供試液。

2.3驗證方法

2.3.1細菌、真菌和酵母菌計數法回收率的測定

薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑對各試驗菌的回收率進行實驗，3次獨立平行試驗結果的均值見表1［3］。

①試驗組：取供試液10 ml到薄膜過濾器中,用無菌的0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，每次100 ml, 并在最后1次沖洗液中加入1 ml的試驗菌液（50～100 cfu/ml）沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預先制備好的營養瓊脂培養基或虎紅培養基平板上，置30～35 ℃培養48 h或23～28 ℃培養72 h。記錄菌落數。試驗組的菌回收率=(試驗組平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數)÷菌液組的平均菌落數×100%。

②菌液組［4］：在過濾器中預先加入大約20 ml的無菌0.9%氯化鈉溶液，再吸取1 ml的試驗菌液（50～100 cfu/ml）到過濾器中，過濾。再用100 ml無菌的0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗1次，取出濾膜，菌面朝上貼于預先制備好的營養瓊脂培養基或虎紅培養基平板上培養，培養方法同試驗組。

③供試品對照組：方法同試驗組，但不加試驗菌液。

④稀釋劑對照組：方法與試驗組同，其中供試液用ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液代替。稀釋劑對照組的菌回收率=稀釋劑對照組平均菌落數÷菌液組的平均菌落數×100%

表1各試驗菌株的回收率　略

從表1可知，在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率、試驗組的菌回收率均不低于70%。可用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗方法檢查硝酸咪康唑搽劑的細菌、真菌及酵母菌數。

2.3.2控制菌檢查方法驗證

①試驗組：取供試液10 ml到薄膜過濾器中, 用無菌的0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 ml, 并在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗菌（驗證銅綠假單胞菌時,試驗菌為銅綠假單胞菌），沖洗后取出濾膜放入預先制備好的相應培養基中，依相應控制菌檢查法檢查。

②陰性菌對照組：方法同試驗組，試驗菌改為50～100 cfu陰性對照菌（2個控制菌驗證的陰性對照菌均為大腸埃希菌）。

③菌液組 ：在過濾器中預先加入約20 ml的無菌0.9%氯化鈉溶液，在吸取50～100 cfu試驗菌到薄膜過濾器中，用100 ml 0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗1次。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預先制備好營養瓊脂培養基上，置（36±1）℃培養48 h，記錄活菌數［5］。

3次平行試驗結果一致，試驗結果見表2。

表2對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的驗證結果　略

從表2可見，用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫ph7.080?氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，方法成立。

3討 論

硝酸咪康唑搽劑為廣譜抗真菌藥，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亞砜等成分，對皮膚癬菌、念珠菌等有抗菌作用，對某些細菌也有一定抑制作用。《中國藥典》2005版規定，對藥品在微生物限度檢查時，其方法應通過驗證，以確認供試品的抑菌活性已被消除而保證檢查方法的可靠性。從本品的微生物限度檢查法的建立研究可見，選用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液作沖洗劑來檢查本品的細菌數、真菌、酵母菌數及控制菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌）的方法有效，在細菌總數、真菌及酵母菌計數實驗中，試驗菌回收率均能達到70%以上；銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查實驗，試驗組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應。本文結果可為同類產品的微生物限度檢查方法驗證提供科學的依據。

微生物論文:淺談如何提高醫學微生物學和免疫學課堂教學質量

【摘要】在醫學微生物學和免疫學課堂教學中，采用循序漸進的原則、多媒體課件教學、運用恰當的比喻、采用啟發式教學、注重歸納總結、加強綜合應用的訓練，能有效提高課堂教學質量。

【關鍵詞】醫學微生物學和免疫學 課堂教學質量

醫學微生物學和免疫學是一門重要的醫學基礎課，與其他基礎課和臨床課聯系緊密。醫學微生物學所研究的對象體積微小、內容瑣碎復雜；而免疫學內容大多是深入到分子水平、概念多、抽象、前后章節內容環環相扣、邏輯推理性強。因此在課程教學中難度較大。筆者在十幾年的教學實踐中積累了一些經驗，就如何提高醫學微生物學和免疫學課堂的教學質量，談幾點體會。

1 修訂部頒教學大綱，使教學內容更符合臨床實際

修訂部頒教學大綱的部分內容相對于新版教材和臨床實際顯得有些落后，我們與臨床教研室經驗豐富的教師經過反復研究，對原教學大綱進行修改。刪去免疫學應用中的補體結合反應、增補補體mbl激活途徑；根據認知規律按抗原、免疫器官、免疫細胞、免疫分子、免疫應答、免疫學應用的順序進行講解。微生物部分將以前要求掌握的脊髓灰質炎病毒改為了解內容；將奈瑟氏菌屬、人類免疫缺陷病毒、密螺旋體屬等內容改為掌握；增補冠狀病毒、禽流感病毒、霍亂弧菌o139、朊粒等較新的內容；增補新發現的“超級細菌”內容；結合學生大多來自農林牧區的特點，特將布魯菌屬、森林腦炎病毒作為掌握內容。修改后的大綱突出重點、兼顧全面、刪繁就簡、循序漸進，力求教學的先進性與實用性，做到了理論聯系實際。

2 采用多種方法提高學生學習醫學微生物學和免疫學的興趣

近年來進入中專學校的學生大多學習基礎差，中專所學知識內容與初中不同，內容多而深。因此，學生對基本概念和基本理論的理解能力差；對物質結構的空間想象力差；邏輯思維能力和解決問題的能力差，而這些又是促成大多數學生對學習興趣低的原因。

美國心理學家布魯納提出：“學習的最好刺激就是對相應內容產生濃厚的興趣。”因此，在講緒論和新的學習內容時，我都精心設計，激發學生對所要學的內容產生濃厚的興趣，以調動學生們學習的積極性和主動性。例如：在講微生物及免疫學的發展簡史、補體、革蘭氏染色等內容時，就以微生物及免疫學科學家（列文·虎克、革蘭等）的真實事跡作為輔助教學的重要手段，通過介紹主人公當時發現問題的背景，遇到過哪些問題及如何解決問題的過程，最終得出什么結論以及有何意義。不僅激發了學生的學習興趣，而且培養了學生發現、分析及解決問題的能力。例如在講ⅰ型超敏反應一節時，筆者導入一些人（身邊熟悉的老師及學生）在日常生活中因冷熱、接觸某些食物、花粉、紫外線等過敏；母親因接觸了嬰兒含有青霉素的尿液而使其過敏性休克而死亡的案例；我又講授蠶豆過敏癥、面食過敏癥、蘑菇過敏癥等的臨床表現，提高了學生的興趣與求知欲，授課效果相當好。

授課內容緊貼生活實際，能提高教學效果。例如：在講消毒滅菌這一節內容時，在煮沸的水中加入小蘇打，不僅提高殺菌力，又可防止金屬器械生銹。就濕熱和干熱哪種消毒效果好進行討論，讓同學們以日常生活體會（移動熱物品時用干手巾還是濕手巾、皮膚容易被水蒸氣燙傷）進行總結。

在教學中選擇能突出微生物及免疫學重要基本理論的臨床問題，這樣就避免理論教學的枯燥與乏味，能活躍課堂氣氛，提高學生學習興趣和教學效果，也能提高學生解決實際問題的能力。例如：輸血時為什么要做和怎么做交叉配血實驗、兒童及解放軍等易受傷人群感染破傷風后如何治療、治療時應注意哪些問題？同種異體器官移植物存活率的高低取決于什么？為什么人對同一種疾病的抵抗力不同等等。

3 按照免疫應答的過程，采用循序漸進的原則講授免疫學基礎部分

例如在講抗原時就采用了如圖3—1流程進行講解，使學生不僅掌握了抗原及相關內容，而且對免疫細胞、免疫分子和免疫應答過程有了初步認識。在講授免疫細胞、免疫分子、mhc及免疫應答時則采用圖3—2流程進行講解，使學生對免疫學的分子水平有了更深刻的認識，較輕松地就掌握了免疫細胞及免疫分子之間的相互作用及免疫應答等復雜內容。

4 科學運用多媒體課件教學，提高教學效果

目前，多媒體技術在教學活動中應用廣泛，越來越體現出其卓越的性能，針對微生物及免疫學課程的內容抽象、較難理解特點，將多媒體教學與傳統教學合理配合，能將抽象的變為直接的、靜態的變為動態的、繁雜的變為簡單的，能充分調動、激發學生學習的興趣和觀察及思考能力，也便于學生對免疫學結構、結構與功能關系的深刻理解，而且學生對所學內容記憶深刻，大大提高了課堂教學效果。例如：免疫球蛋白水解片段的講授、k細胞的adcc效應、補體的經典激活途徑、金黃色葡萄球菌引起燙傷樣皮膚綜合征、艾滋病臨床表現等。

5 運用恰當的比喻，將抽象內容形象化、生動化

在講授免疫系統時，將中樞免疫器官(骨髓與胸腺)比作是t、b細胞“革命圣地延安”，t、b細胞在此發育分化成熟，并學會了“認清敵我”（識別）的本領后離開，到外周免疫器官（淋巴結、脾臟等）開展工作，并不斷巡視（淋巴再循環），一旦出現（衰老死亡和突變的細胞、病原微生物等抗原性異物侵入）情況，t、b細胞立刻識別并在接收到“雞毛信”（雙信號）后分化增殖為效應t細胞及抗體，它們再“招兵買馬”（淋巴因子、穿孔素、顆粒酶、補體、吞噬細胞、k細胞等）形成龐大軍隊以不同方式去“殲滅清除敵人”。

抗原、抗體的特異性好比“鑰匙與鎖”的關系，“一把鑰匙只能開一把鎖”。

將補體激活酶促級聯反應比作“多米諾骨牌效應”。

6 在免疫學理論教學中注重采用啟發式教學

醫學免疫學知識連貫性很強，前后章節內容聯系緊密。因此在教師的教學及學生的學習過程中，要正確認識免疫學結構體系是學好免疫學的基礎。否則學生就會對免疫學的普遍反映是枯燥、難理解、難記憶。因此，教師在授課時要采用啟發式教學。啟發學生深入思考、討論，要把前面部分所學習的免疫學基本概念、基本知識、基本原理有機地運用于對各種免疫機制（如抗原識別機制、抗體免疫效應機制、ctl/nk/k細胞殺傷靶細胞的機制、各型超敏反應的發生機制、各種臨床常用免疫學檢測技術及防治的原理）的學習和領會中去。更要注重啟發學生運用所學的免疫學知識認識、理解臨床實際問題，臨床應用某些抗生素及抗體制劑時應該注意什么問題，怎樣避免或減少超敏反應的發生？器官移植為什么要做組織細胞配型？這樣學習既能學以致用，又能反過來促進、加深學生對免疫學的認識理解。

7 加強綜合應用的練習，注重歸納總結

俗話說得好，“熟能生巧”。成功的關鍵在于勤學苦練。練習的意義在于檢驗自己，對學習形成反饋調節，提高學習效果。學生通過做練習可以發現自己在學習中的薄弱環節、認識中的片面和錯誤，檢驗學習的效果，同時又是一種將所學書本知識加以運用以解決問題的實習機會。教師通過學生做練習，可以及時發現學生存在的問題，做到真正地因材施教、有的放矢，提高教學質量。

在此基礎上還要引導學生進一步橫向比較，在深層次上掌握基本知識及基本概念。如抗體與免疫球蛋白的區別、補體活化經典途徑、旁路途徑及mbl途徑的區別、tcr與bcr的區別、mhc—ⅰ和mhc－ⅱ類分子的區別、病毒與細菌的主要區別、致病性葡萄球菌與鏈球菌在致病因素和在引起局部化膿性感染時各有何特點？能引起食物中毒的細菌有哪些等。通過總結學生們才能更加深刻理解，更好地記憶，從而學好微生物學及免疫學。

只有激發起學生學習微生物學及免疫學的興趣，把抽象問題形象化、生動化，充分發揮現代化教學優勢，采用啟發式教學，深入思考討論，歸納總結，微生物學及免疫學的課堂教學質量一定會得到提高。

微生物論文:甘草有益微生物的研究進展

作者：崔浩然，牛小宇，劉春生

【摘要】 植物體內大量分布的微生物對植物產生的影響已成為人們關注的熱點，特別是那些有益的影響可對植物的生長及活性成分的形成產生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質量一直是人們所關心的問題，甘草有益微生物對提高甘草的品質有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進展，以期對提高栽培甘草的質量起到指導意義。

【關鍵詞】 甘草; 內生菌; 根瘤菌; 菌根真菌

甘草是豆科甘草屬(glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場需求量大。近年來，隨著野生甘草資源的急劇減少，且國家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對甘草資源的保護性利用及栽培甘草勢在必行。近年來，隨著人工甘草種植面積的逐年加大，提高甘草的質量成為亟待解決的一個關鍵問題。相關研究表明，植物有益微生物可以產生促植物生長的活性物質，提高植物固氮性能，促進植物對惡劣環境的適應，加強系統的生態平衡，保證寄主植物健康生長。因此本文就近年來甘草有益微生物的研究進展進行綜述，以期對提高栽培甘草的質量有指導意義。

1 甘草內生菌的研究現狀

內生菌是指一生或至少一生中的某個階段能進入活體植物組織內，并且不引起明顯組織變化的真菌或細菌［1,2］。1993年，strobel等［3］從短葉紅豆杉taxus brevifolia nutt的樹皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內生真菌taxomyces andreanae能產生紫杉醇，這一研究結果引起學者對內生菌的廣泛興趣。目前，人們已經從長春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內生菌，并取得了一些成果。

有學者對甘草內生菌也進行了研究，發現內生菌對甘草產生一系列作用。宋素琴等［4］對采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內生菌進行分離，并純化得到149株細菌和2株真菌，鑒定得出149株細菌分屬于13個屬，2株真菌分屬于青霉菌屬penicillium和鐮刀菌屬fusarium。有學者發現內生菌可通過拮抗病原菌促進甘草生長。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內生細菌98株，并采用平板對峙方法篩選出6株菌株，其對植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢桿菌(bacillus atrophaeus)、多粘類芽孢桿菌(paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)、paenibacillus ehimensis。龔明福等［6］采用無菌操作技術從野生健康甘草glycyrrhiza uralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內生細菌（endophytic bacteria)125株，其中31株對棉花枯萎病菌(fusarium oxysporum)、棉花黃萎病菌(verticillium dahliae)具有較強的拮抗活性，這31株內生細菌分屬于氣芽孢桿菌屬(aerobacillus sp.)、氣單胞菌屬(aeromonas sp.)、芽孢桿菌屬(bacillus sp.)、黃單孢桿菌屬(xanthomonas sp.)、假單胞桿菌屬(pseudomonas sp.)、土壤桿菌屬(agrobacterium sp.)。另有研究發現，從甘草中分離的有些內生菌還可產生活性物質。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內生菌，從中篩選出一個來自烏拉爾甘草的菌株mesorhizobium sp. ccnwgx022，從該菌株發酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內酯rhizobialide，是第一次從內生菌中得到此類物質。另有學者研究了內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量變化趨勢。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內生細菌，研究阿拉爾地區豆科植物內生細菌種群動態。結果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內生細菌的種類最多。內生細菌種類的分布規律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長期中總帶菌量平均值在各個月份變化趨勢不同，并且各個月份的帶菌量處于交替變化之中，說明不同月份5種豆科植物內生細菌的種類和數量不同，同種豆科植物不同組織部位的內生細菌的種類和數量有差異。

2 甘草根瘤菌的研究現狀

根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的一類桿狀細菌。這種共生體系具有很強的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類型，為化能異養菌。目前有學者已經從甘草中分離得到根瘤菌并進行了一些相關研究。

目前對甘草根瘤菌的研究多體現在根瘤菌的分類上。楊雪穎等［9］通過對西北干旱半干旱地區68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發現1個新類群和1個具有較高抗逆性的菌株。對新類群的中心菌株ccnwgx022和高抗性菌株ccnwgx035進行16srdna全序列測定及系統進化研究。結果表明，ccnwgx022和ccnwgx035與中慢生根瘤菌屬內參比菌株的16srdna相似性分別大于96.8％和98.3％，判定它們均屬于中慢生根瘤菌屬。谷峻等［10］采用表型數值分類、16s rdna pcr-rflp分析和box-pcr指紋圖譜分析的方法對中國北方地區的甘草根瘤菌進行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數值分類聚類分析中約85％的相似水平上產生2個表觀群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16sr dna pcr-rflp分析表明，供試的20株菌共產生14種遺傳型，表現出豐富的遺傳多樣性。box-pcr指紋圖譜分析進一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結論：在中國北方地區與甘草共生的根瘤菌在sinorhizobium、rhizobium和mesorhizobium屬中均有分布。

3 甘草菌根真菌的研究現狀

菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌，大部分屬擔子菌亞門，小部分屬子囊菌亞門。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，并各有形態特征，這是真核生物之間實現共生關系的典型代表。根據形態和解剖學的特征，又把菌根分為外生菌根和內生菌根兩大類。有學者對甘草菌根真菌進行研究發現菌根真菌可促進甘草的生長。饒小莉等［11］分離了甘草的va菌根，并用三葉草進行單孢繁殖，將繁殖后的菌根真菌回接甘草，結果發現接種了菌根真菌的甘草植株筆長、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對照顯著增加，并且不同處理對植株生長影響不同，得出結論接種va菌根真菌顯著促進了甘草的營養生長。jingnan liu等［12］用兩種am菌根真菌glomus mosseae與glomus versiforme接種甘草，結果顯示接種的甘草相對于對照組在生長的早期和晚期有顯著提高，葉攝取磷的量比對照組多，并且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對降低了，由此得出結論接種am菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價值的有效途徑。

4 甘草其他微生物學相關研究現狀

近年來，對甘草微生物學轉化等方面的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發根農桿菌的ri質粒，以光果甘草種子胚萌發形成的實生苗不同部位為外植體，成功誘導出光果甘草毛狀根，并利用tldna中rolc序列中的特異性引物，應用pcr技術對光果甘草毛狀根進行了分子水平的鑒定，并利用理化手段對毛狀根轉化后產生的冠瘦堿進行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源ri質粒的t-dna片段。燕飛等［14］利用發根農桿菌r1601對藥用植物脹果甘草(glycyrrhiza inflat bat)進行轉化，誘導其產生發根。在發根誘導過程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時間對脹果甘草子葉、胚軸進行轉化處理，統計、比較各條件下的發根率，結果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8 min時，發根誘導率最高,為56.49%。何晨等［15］用一株產β-葡糖醛酸酶的菌種hc-12對甘草進行液體發酵轉化。通過對菌種復合誘變以及應用系統數值化及靈敏值系統調控技術優化了發酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經過柱層析及hplc及1h nmr鑒定分離得到了甘草次酸純品，并通過動物實驗驗證了發酵甘草于未發酵的生品對照甘草具有抗炎活性和鎮痛作用顯著性效果。

5 小結

內生菌對甘草的有益作用體現在：①內生菌有促進甘草生長作用，內生菌可與病原菌競爭營養或直接產生拮抗物質而抑制病原菌，從而促進甘草生長。②有些內生菌可產生活性物質。③內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量呈現一定的變化趨勢。另有研究表明，內生菌能產生與宿主相同的活性物質［3］，王興紅［16］推測內生真菌可能與中藥的道地性有密切的關系。這些成果對于甘草內生菌的研究有重要意義。

根瘤菌對甘草的有益作用體現在：根瘤菌能夠通過與甘草共生，引起甘草根部或莖部結瘤，將空氣中的n2轉化為可吸收利用的nh4，從而為甘草提供氮素營養，促進其生長。

菌根真菌對甘草的有益作用體現在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關系，它們之間可以交換各自所需的物質，甘草借助菌根真菌吸收水分、養分和生長促進劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長所需要的糖分和其它有機物。菌根真菌是根系的延長和擴展，且比根系吸收水分、養分的能力大得多，可促進甘草的營養生長，提高甘草的藥用價值。

微生物轉化對甘草的作用體現在：對甘草進行微生物轉化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。

總之，微生物是個潛力巨大、尚待開發的資源，對甘草相關微生物進行研究有重大意義，有利于提高甘草的質量，對于中藥的可持續發展也將起到重大作用。

微生物論文:淺談互動教學為核心的環境微生物實驗教學方法探索與實踐

論文關鍵詞：微生物　實驗　互動　研究

論文摘 要：環境微生物實驗是環境學領域的一門重要基礎課程。本文以傳統的實驗教學方式為基礎，提出了以“先立觀念，互動教學，科研教學”實驗教學模式為核心的實踐經驗，并從中獲得了一些啟發與體會。

環境微生物學作為環境工程專業、環境科學專業的必修專業基礎課，是以普通微生物學為基礎，并在研究微生物學的一般規律的同時，更注重微生物與環境之間的相互作用規律的一門課程[1]。環境微生物是微觀的、肉眼看不見的，需要抽象思維，總體而言枯燥乏味。所學知識雖與專業相關，但學生尚未接觸科學研究，所學內容離日常生活較遠，學習目的性大打折扣，難以激發學生學習興趣。因此，與其他專業的微生物課程類似，在進行環境微生物學的理論教學的同時，配合一定課時量的實驗教學，以其調動學生對理論學習的興趣，提高對理論知識的認知能力。

另一方面，隨著環境微生物學的發展，例如無菌操作、培養基制備、消毒與滅菌、微生物的培養分離計數等微生物學中最基本的一些技術在環境污染處理等生產研究領域中應用十分廣泛，對整個科學技術和社會經濟發展發揮著重大作用。因而，微生物實驗教學也是課程理論與實踐應用相結合的橋梁和紐帶，在學生專業技能培養中具有十分重要的作用。那么，如何充分調配環境微生物學實驗的內容及授課方式，讓學生真正掌握所學知識，培養具備理論知識扎實、動手能力強且能將所學知識靈活運用創新能力的學生，一直是值得思考和努力的問題。本文根據環境微生物學實驗教學過程中存在的問題，提出了“先立觀念，互動教學，科研教學”為中心思想的教學方法，以其為進一步提高環境微生物學實驗教學效率提供系列應對策略。

1 先立觀念

微生物實驗與物理化學實驗不同，其研究對象是形體微小、分布廣泛、無處不在的細菌、病毒和真菌。尤其是在進行某種微生物的分離、純化及培養過程中，無菌操作技術是整個實驗的重點。尚未接觸微生物學實驗的學生不能深刻注意到與其它學科實驗的差異。其它學科實驗的操作是在開放的空氣中進行的，而微生物學實驗尤其是研究工作中，許多實驗操作是在相對隔離的環境中進行的，以保證不受環境中微生物的污染。因此，在學生尚未養成不良實驗習慣之前，就必須讓其建立無菌操作的概念。筆者在第一次課堂上，就針對整個課程周期內的行為規范要求做一次詳細說明，培養學生規范的操作技術。讓學生理解什么樣的操作是規范的，什么樣的操作會引起實驗的失敗。結果表明，缺少這部分內容的教育，在后面的實驗活動中，學生往往會不自覺養成一些不良習慣，無菌操作概念則相當薄弱。因此，我們強調先立觀念。大學的環境微生物學實驗是他們第一次接觸微生物，在最初階段就讓學生知道整個課程的基本規范，會讓他們受益匪淺。

2 互動教學應貫穿整個實驗教學

常規的實驗教學，通常由理論教學和實驗教學兩部分組成。即，教師講解本次實驗的目的、原理、材料、操作步驟及注意事項，然后學生各自分組按操作步驟進行實驗。此處，教師的課前講解是學生進行實驗的前提與基礎，是學生是否能充分理解本次實驗流程的關鍵要素。因此，教師工作者十分關注如何能提高教師講解的效率以擴大學生的理解[2]。筆者發現，若將互動教學法引入到實驗課中，同樣十分有效，它是充分發揮教師和學生兩個主觀能動性的教學方法。那么實驗課的互動教學法是以何形式出現的呢？筆者通過實踐，摸索出了“問答式”、“答問式”、“師生討論啟發式”、“實驗結果展現”、“多媒體教學”等多種形式，教師可以根據不同的教學內容，有選擇地加以使用。

(1)“問答式”與“答問式”。“問答式”即在講完實驗理論后由教師針對本次實驗的關鍵問題進行提問，然后由學生回答。如“細菌涂片制備與染色”實驗中，教師可以詢問學生革蘭氏染色的原理與步驟等。這不僅能促進學生理解的效率，還能讓教師從中了解學生的掌握程度，并可針對學生不懂之處解答；“答問式”則通常在“問答式”之后，即要求學生針對實驗提出若干個問題，由教師回答。眾所周知，在大多數情況下，中國學生往往會帶著疑問進行實驗操作，直至出現問題后才會找老師解答，或甚至不問。而這種情況對于實驗操作教學是十分不利的。因此，培養學生在實驗前把整個過程弄明白，不留疑問的進行后面的實驗，是教師們一直以來努力的目標。筆者發現，從第一次課程點名鼓勵提問，到后面幾次課的踴躍提問，寬松的互動問題環節還是比較受歡迎的。其中有很多問題是教師認為比較簡單的一些操作，所以先前并未講解透徹，而學生卻一知半解。當他們提問后教師解答，則能讓整個實驗的進行事半功倍。因此，讓學生習慣并喜歡“答問式”是一個循序漸進的過程，也是一個非常有利于教學效果的方法。

(2)“師生討論啟發式”分兩種形式，即口頭和書面形式。口頭形式通常在課內完成，即在學生在實驗期間，與老師的交流。如此，使學生學到較多實驗知識與技巧。并且，教師可在下課前集中講解實驗過程中出現的新現象、新問題，糾正學生常見的習慣性錯誤，培養學生良好的實驗操作習慣。書面形式，則是要求同學在完成課內的實驗操作后，實驗報告除了目的、原理、方法、結果和思考題外，還應有相應的分析和討論。以往，學生撰寫報告往往把實驗原理、材料、操作方法和實驗數據等簡單地羅列，未能對實驗中遇到的問題進行分析討論。為了使學生深刻理解和掌握實驗內容，探討成功的經驗和失敗的原因，提高分析問題、提出解決方案和實施解決方案的能力，筆者要求學生如實記錄操作步驟和實驗結果，尤其是鼓勵將操作步驟以圖示的方式表示出來，而非從資料上抄下來大段大段的文字。此外，鼓勵其將實驗中出現的各種結果進行分析討論，對于實驗取得與預期相符結果的，分析成功的關鍵和經驗。對于未取得預期結果的，分析導致實驗失敗的原因。對于學生提交的實驗報告，教師在批閱過程中逐一點評。筆者在評閱實驗報告時常遇到以下內容：“本次實驗失敗了，主要原因可能是培養基制備時瓊脂濃度過低”；“這次實驗我們成功分離到了纖維素降解菌”。這讓教師及時了解學生對課程的意見與想法，能促進今后課程開展的及時改進。

(3)“結果展現式”應用的典型例子就是在“顯微鏡的使用與細菌形態觀察”這一實驗。這個實驗最主要的目的就是讓學生通過顯微鏡的觀察，對各種微生物細胞的基本形態特征有一個直接的感性認識。筆者所在教學實驗室建立了一個互動實驗室平臺，即教師顯微鏡下的視野能直接投影到大屏幕讓全體學生看到，每組學生用的顯微鏡視野也能切換到大屏幕上去。如此一來，所有同學都能看到老師做的微生物裝片情況，各組之間的情況大家也一目了然。在觀察微生物的形態、大小時，學生對看到顯微鏡下的物體常有誤認。實驗中，常常有學生把雜質當作了細菌細胞，需經過老師的指點才能看到了真正的細菌細胞。在互動教室中教師可以在大屏幕上對每一個成像進行分析辨認，從而輕松讓每一個學生看到各個小組制作的真實菌體。另外，同學與同學之間也會就實驗現象差異進行討論，交流成功或失敗的經驗。筆者曾對學生做了調查，90%以上同學都十分認可將自己的實驗成果與全班分享。

(4)隨著科學的發展，理論部分的教學已離不開多媒體教學，但實驗教學大多數仍保持著固有形式，如板書等。為了能在有限的課時內準確生動地將最基本的操作技術介紹給學生，提高實驗課程的教學水平，我們在將多媒體技術應用到微生物學實驗課程教學方面進行了一些有益的嘗試，受到了學生的普遍歡迎。即每次課程均會播放一段教學視頻，如“培養基的配制與分裝”、“玻璃器皿的包扎”、“細菌的接種”、“革蘭氏染色”等。通過生動形象的教學示范，可以讓學生更為形象的了解微生物操作技術的細節要求，培養出微生物操作技術更為扎實的學生。或者在“污水中常見微生物觀察”實驗中，讓學生觀察后拍攝照片視頻錄像，并對影響資料進行標注，如添加標尺、調節曝光時間等，通過提高學生的興趣來增強他們對知識點的記憶。因此，充分利用多媒體的有利條件，將實驗課程教學建立在現代教育技術的平臺上應逐漸成為當前形式下高等教育改革和發展的目標[3]。

3 實驗教學與科研教學的關系

3.1 驗證性與研究性教學的有機結合

微生物實驗課的開設大多是根據理論教學的進度，設置相對應的實驗。實驗項目來自實驗指導書，書中從實驗目的、原理、器材、步驟及注意事項等內容都作了全面而具體的說明，所做實驗基本上都是驗證性的，學生只需照做，最后完成實驗報告即可。整個過程缺少了能讓學生好好動腦思考的環節。雖然，實驗項目的選擇都是從眾多實驗中篩選出來的具有實際應用價值，但大多是相對孤立的，學生會搞不清實驗一和實驗二之間有沒有關系，有沒有學的必要。如果，教師將其中一部分驗證性實驗項目進行科學合理的串聯，使學生掌握基本操作技術后，適當安排一些研究性的實驗項目。將實驗項目告知學生，要求學生參考實驗指導書和相關的期刊，分組寫出試驗設計，進行研究性學習。教師對各個小組進行具體指導，包括實驗步驟、實驗所需器材的準備等。同時，鼓勵各小組選擇不同的實驗項目，觀察結果時互相交流討論。如“污水中大腸菌群的測定”這一實驗中，可告訴學生采用中華人民共和國國家標準gb/t 5750.12-2006中的多管發酵法，由學生自行去網絡資源中查找具體的資料，制作實驗方案，由教師審核后開展實驗。

3.2 研究性與開放性教學的循序漸進

雖然，上述研究性實驗項目能培養學生的獨立思考及設計能力，但是以培養高素質的創新人才而言仍然是不夠的。因此，還可開設一些開放性實驗課程，即3～4個學生組成的項目小組選擇某位專業指導老師，開展一個結果未知的研究項目，實現實驗教學與科研的真正結合[4]。如“化工廢水中某降解菌株的篩選分離”、“水體藻類對某化合污染物的響應研究”等。課題組獨立完成實驗方案實施的全過程，指導教師隨時對實驗過程中的技術重點、難點進行指導和把關。教師除平時進行指導外，還定期組織學生進行學術交流。通過學術交流便于指導教師詳細掌握各組的實驗進度、存在問題等，并指出努力方向。實驗結束時，每名學生寫出正式規格的實驗研究論文，由指導老師進行評定并備案。

總之，以培養學生創新精神和實踐能力為重點的素質教育正在普遍實施，我們針對環境微生物實驗教學進行的一些“互動”改革，仍是初步探索，期望能對進一步推動實驗教學改革的進程提供一些新的思路。

微生物論文:試論“土壤微生物的分解作用”實驗的改進

摘要　針對“土壤微生物的分解作用”這個實驗在教學中開展出現的幾個問題,對實驗方案進行了相應的改進,以期對教學實踐有一定的參考價值。

關鍵詞 土壤微生物　分解作用 實驗改進

“土壤微生物的分解作用”是新課程標準中設置的一項活動,旨在使學生能從實驗的角度去探究土壤中落葉等物質的消失源于土壤微生物的分解作用。筆者經調查發現,浙江省新課程實施兩年以來,開展該實驗的學校寥寥無幾,多數一線教師反映該實驗周期長、實驗現象不明顯,而更主要的是大多學校不具備實施該實驗的設備裝置,鑒于此,下面設計了該實驗的3個改進方案,以供大家參考。

1　改進方案一

草莓是在土壤微生物的作用下腐爛的嗎?

本實驗采用對照實驗的方法,設計對照組和實驗組。對照組的土壤不做任何處理(自然狀態);實驗組的土壤要經過高壓滅菌處理,以盡可能排除土壤微生物的作用,同時要盡可能避免土壤理化性質的改變。所選用的草莓都要進行徹底滅菌處理。

(1)實驗材料:土壤、草莓若干(可根據季節自行選擇其他水果)、70%的酒精、升汞。

(2)實驗器材:無菌操作臺、高壓滅菌鍋、泡沫碗、鏟子、培養皿、鑷子等。

(3)實驗步驟:

①采集土樣。選取適量較肥沃的土壤等量分裝于兩個泡沫碗中,做好標記備用。

③土壤處理。將其中的一碗土壤用報紙包好,同培養皿、鑷子等一起放入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20 min(實驗組)。另一碗土壤不做處理,保持自然狀態(對照組)。

③草莓處理。將所選用的草莓用70%的酒精進行10 s消毒處理,并用升汞進行20 min滅菌,最后用無菌水洗3-4次,殺滅草莓表面的微生物。

④將滅菌處理后的草莓分別埋人兩盒土壤中(深3-5 cm),并將2組實驗材料放入無菌培養室(注意:實驗組要在無菌條件下操作)。

⑤隔天觀察草莓的腐爛程度,并對其進行描述,得出實驗結果。

(4)實驗結果:實驗第3 d對照組開始腐爛,第5 d實驗組個別草莓開始有變化;第7 d,實驗組個別草莓有一定程度腐爛,對照組幾乎所有草莓都有不同程度腐爛。

(5)實驗結論:對照組與實驗組除了對土壤的處理不同,其他條件完全一樣,實驗結果不同,說明未經滅菌處理的土壤中確實存在使草莓發霉的微生物。

2　改進方案二

面包是在土壤微生物的作用下腐爛的嗎?

本實驗采用對照實驗的方法,設計對照組和實驗組。對照組的土壤不做任何處理(自然狀態);實驗組的土壤要經過處理(在微波爐里加熱10min),以盡可能地排除土壤微生物的作用,同時要盡可能避免土壤理化性質的改變;面包要在微波爐里面進行滅菌處理。

(1)實驗材料:土壤、面包。

(2)實驗器材:微波爐、泡沫碗若干、報紙、鏟子、鑷子、錐形瓶等。

(3)實驗步驟:

①采集土樣。選取適量較肥沃的土壤等量分裝于8個泡沫碗中,做好標記備用。

②土壤處理。將其中的4盆土壤用報紙包好同鑷子等一起放入微波爐滅菌20 min,該組為實驗組。另4盆土壤不做處理,保持自然狀態,作為對照組。

③面包處理。將新烤的面包切成若干大小相等的塊狀,放在錐形瓶中,將錐形瓶放到微波爐里加熱,進行徹底滅菌處理,殺死面包中含有的微生物。

④滅菌處理后的面包分別埋入8碗土壤中(深3-5cm),用報紙將泡沫碗包好,并將2組實驗材料放入無菌培養室(注意:實驗組要在無菌條件下操作)。

⑤隔天觀察面包的腐爛程度,記錄實驗結果,一周后,實驗組面包完好,而對照組面包發霉。

(4)實驗結果:實驗第8 d對照組開始發霉,第10 d對照組面包上長滿了長長的“毛”,而實驗組完好。

(5)實驗結論:對照組與實驗組除了對土壤的處理不同,其他條件完全一樣,實驗結果不同。這說明未經滅菌處理的土壤中確實存在使面包變質的微生物。

3　改進方案三

探究土壤微生物對淀粉的分解作用。

本探究實驗將對土壤微生物的分解作用的探究和對淀粉及還原性糖的鑒定較好的結合在一起,既能完成新的探究實驗,又能對必修1中的重要實驗“鑒定淀粉和還原性糖”起到很好的復習作用。

(1)實驗材料及藥品:土壤、淀粉溶液、蒸餾水、碘液、斐林試劑。

(2)實驗儀器:高壓蒸汽滅菌鍋、燒杯、試管、玻璃棒、膠頭滴管、酒精燈、電子稱等。

(3)實驗步驟:

①將取自農田的土壤放入里面墊有紗布的燒杯中,加水攪拌,然后將紗布連同土壤一起取出,將留在燒杯中的土壤浸出液靜置一段時間備用。

②取兩只錐形瓶,編號a、b,放入等量(約30ml)淀粉溶液,高壓蒸汽滅菌20min。

③在a錐形瓶中加入30ml土壤浸出液(實驗組),b錐形瓶中加入30 ml無菌水(對照組,需無菌操作),分別用牛皮紙封口(隔菌通氣)。

④在室溫(20℃左右)下放置7 d后,分別取a、b錐形瓶中的溶液5 ml,各放入兩支試管中,分別編號a1、a2、b1、b2。

⑤在a1、b1中加入碘液,在a2、b2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2～3 min。

⑥觀察試管中溶液的顏色變化,記錄實驗結果,得出實驗結論。

(4)實驗結果:1周后,a1中加入碘液仍為紫色,b1中加入碘液變為藍色,a2、b2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2-3min沒有變化;2周后,a2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2-3min,變磚紅色,b2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2-3 min仍無顏色變化。

(5)實驗結論:對照組與實驗組除了對土壤的處理不同,即所得的土壤浸出液成分不同,其他條件完全一樣,實驗結果出現不同的顏色,說明了未經滅菌處理的土壤得到的土壤浸出液中存在某些微生物,使得淀粉被分解成為還原性糖。

4　總結

方案一選擇草莓作為材料,周期短,效果好,但有季節限制;同時本方案滅菌效果徹底,但對實驗儀器的要求也比較高,所以適用于實驗設備條件較好的中學。考慮到有些學校實驗設備條件有限,沒有高壓滅菌鍋、滅菌臺,所以方案二選用微波爐來滅菌,這是生活中常見的電器容易獲得,適合實驗設備條件一般的中學;同時本方案選擇面包作為材料周期較長,但面包價格便宜,且沒有季節限制。教材對方案三沒有說明加入淀粉糊的濃度和量,以及所加淀粉糊在7 d后是否完全被分解,沒作鑒定說明,這將會直接影響實驗結果,本文在教材方案基礎上針對性的對其進行改進,并增添了鑒定實驗,使得實驗更加嚴密,提高了可操作性。

微生物論文:關于高職微生物課程教學改革探索與實踐

論文摘要：微生物課程是生物制藥專業重要的職業基礎課程，在本專業的許多課程教學中起著承前啟后的作用。本文從生物制藥專業發展概況及培養目標入手，對微生物課程教學地位及教學目標進行分析，闡述了微生物課程教學改革的探索與實踐。

論文關鍵詞：高職；生物制藥；微生物課程；教學改革

生物制藥專業發展概況及培養目標

生物制藥是運用微生物學、生物學、醫學、生物化學等研究成果并綜合利用微生物學、化學、生物化學、生物技術、藥學等科學的原理和方法制造用于預防、治療和診斷的制品。生物制藥產業是國民經濟的重要組成部分，《中華人民共和國國民經濟和社會發展第十一個五年規劃綱要》和《國家中長期科學和技術發展規劃綱要（2006-2020年）》中明確指出“要大力發展生物產業”。目前，全世界的醫藥品已有一半是生物合成的。

近年來，我國醫藥行業的迅猛發展，特別是生物技術在醫藥產業中的廣泛應用大大加快了生物與醫藥類等高職院校生物制藥專業的發展壯大。其培養目標是：德、智、體、美全面發展，具有與本專業領域方向相適應的文化水平與素質、良好的職業道德和創新精神，掌握本專業領域方向的技術知識，具備相應實踐技能以及較強的實際工作能力，熟練掌握并能從事藥物的研發、藥物的生產、藥物的質量及安全檢驗、藥理分析、藥物的經營和銷售等工作的高技能型人才。

微生物課程教學地位及教學目標分析

半個世紀以來，微生物轉化在藥物研制中一系列突破性的應用給醫藥工業創造了巨大的醫療價值和經濟效益。隨著新微生物資源的發現、新的藥物篩選模型建立以及各種新技術的應用，從微生物次級代謝產物中尋找新藥所顯現的優勢將繼續存在，事實證明微生物制藥在整個生物制藥產業中占有舉足輕重的地位。微生物學在理、工、農、醫、師范院校與生物相關專業的課程設置中占有重要的地位，也是一門實踐性很強的學科。

由此可見，微生物課程也必然是生物制藥專業的重要職業基礎課程。它系統地介紹了微生物的分布、分類、形態結構、生長繁殖、遺傳變異以及與人類生產生活的關系等理論與實驗操作技術，要求學生具備一定的生物學與生物化學基礎知識。其后續課程包括發酵工程概論、生物技術制藥、制藥工藝學、藥品分析與檢驗、藥劑學、藥事管理與基因工程技術概論等多門主干課程。

本課程的教學目標是使學生能夠正確掌握微生物分類、結構、生理活動等基礎知識，確保學生能夠進行有關微生物生產的必要基本技能操作，并掌握應用微生物學理論知識分析問題和解決問題的基本方法，從而為后續的職業技術課程的學習與生產實踐奠定必要的理論基礎和實踐技能。

微生物課程教學改革探索與實踐

長期以來，全國各高校微生物學教學大多以課堂講授為主，配合適量實驗課。學生學習微生物學的方法常常是課上勤筆記少思考、課下不復習少作業，考前死記硬背、考后“完璧歸趙”。為了提高微生物課程教學效果與學生的實踐技能，我們于2008年申報了《微生物及其應用》院級精品課程，并與全省其他高職院校的同仁一道對生物制藥及相關專業的微生物課程教學改革進行了一定的探索與實踐。

（一）優化教學手段與方法

主要教學手段 合理利用學院優越的教學條件是提高課程教學質量的基本手段。在本課程教學中，我們充分利用學院完善的多媒體教學資源、電視顯微鏡設備組織教學，通過多媒體課件、視頻、標本與即時的實驗操作進行形象、直觀的教學。同時，加強與本地區制藥企業的聯系，與企業一線生產人員共同探討課程教學內容。

教學方法探索 在教學方法上，我們依據高職類學生文化基礎、思維特征，針對不同的具體內容選擇采取了項目教學法及案例導入法等多種“教學做合一”的形式開展教學，從而實現了將過去以教室為中心的學習形式向以實驗室工作過程為中心和“邊教、邊學、邊做”形式的過渡。例如，將基礎知識部分組織成多個承前啟后的項目，微生物應用部分（如微生物與發酵、食用菌栽培與藥品的微生物污染檢測等）采用案例法組織教學。通過啟發與討論、理論密切聯系實際等方法引導學生加深對所學知識的運用、提高學習的興趣與積極性。提供適量學時，鼓勵有積極性的學生自選教學內容，采取合作或獨立查閱資料和制作多媒體課件進行授課的形式實現了師生主體角色的轉換，從而使學習以形成綜合能力為目的而非單純的知識攝取。同時鼓勵學生在實驗教師的指導下，根據自身興趣進行微生物實驗的設計與操作。

在有了一定的手段與方法基礎上，我們認為利用適當的幽默或英文等教學技巧也是提高教學效果的良策。比如在要求學生列舉已知的病毒時“特意提醒”不要自作聰明地制造“人瘟病毒”。在課堂中偶爾適時地穿插一個英語單詞或簡單的句子能夠起到很好的調節作用，往往能讓喜歡或不喜歡英語的學生激發興趣。

（二）認真整合教學內容

內容的選取與組織 2007年下半年，在長期從事企業生產實踐的“雙師型”教師共同參與下，我們編寫出了一本較為符合當前高職教育理念的湖北省“十一五”規劃教材——《微生物及其應用》并獲2009年湖北省高職高專優秀規劃教材獎。本教材根據當前高職院校生物制藥專業的培養目標及湖北省示范院校生物制藥專業人才培養方案建設要求建立課程教學標準與內容，按照“教學做合一”模式進行教學內容的合理融合。在內容的組織上充分考慮高職學生的文化基礎與思維習慣，適當降低了理論知識部分的深度，強化了微生物在生產實踐中的應用。將課程內容按照微生物由大到小、由表及里的原則進行重新組合，首先使學生通過顯微鏡對各種微生物進行最基本的感性認識，然后逐漸了解微生物的培養技術及其在生產中的應用，從而順其自然地完成對整個微生物課程內容由感知到認知的知識延伸與拓展過程。

教學組織與實踐 為了較好地落實高職教育所推崇的“邊做邊學，邊學邊練”行動導向的教學理念，我們采取的是理論與相應實踐操作（單元實驗）相互融合的模式開展教學，并將教學內容劃分為“基本知識與技能”和“知識與能力運用”兩大模塊，其中包含了“微生物形態觀察技術”、“微生物分布與生長控制技術”及“微生物應用與檢測技術”三個單元與七個項目來實施教學。在此基礎上，我們還開發了《微生物及其應用》院級精品課，并在教學中認真踐行“邊做邊學，邊學邊練”的教學方法，使學生能夠自覺地將所學知識與實踐相結合，從而既增強了學生學習的主動性，同時又較好地鍛煉了他們的動手能力，強化了教學效果。

重視第一次課設計 第一次課是一門課程的序曲，它是引導學生進入微觀世界、激發學生求知欲望、增強課程魅力的最佳向導。本課程的第一次課是通過“一個富有創造和啟迪性的故事（列文虎克）”、“多幅彩色動靜態圖片的展示”和“一系列驚人的數字”等具有鮮明特色和感性認識的內容逐步展開的，非常強烈的視覺效果讓學生產生了對微生物的濃厚興趣，進而較好地激發了他們對本課程的學習熱情和探究心理，當然也取得了非常好的教學效果。

（三）強化實踐教學與考核

加大實踐教學比例 本課程的教學目的是為后續的職業技術課程學習與生產實踐打下良好基礎，滿足生物制藥生產、建設、管理和服務第一線的技術應用型人才對微生物知識與技能的需要，同時培養學生創新精神和創業能力。因此，我們按照“教學做合一”的模式將理論知識與有關實驗內容進行了有機融合，因而也在很大程度上減少了理論學時，相應增加了實驗操作學時，使理論與實踐學時之比將近1∶1。將課程的實驗分為平時的單元實驗、期末整周的綜合實訓、培養興趣的自主實驗（如對口腔、霉變水果中微生物進行分離培養等）幾項，并著重培養學生的無菌操作技能和微生物實驗安全意識。

改革實踐考核制度 在對本課程教學模式進行探索與實踐的同時，我們對其考試制度也進行了改革。改變了傳統的以理論為主、實驗為輔的考試為理論考試和實驗操作考核并重的新型綜合考試制度。使實驗成績與理論成績之比達到1∶1，其中實驗考核以實踐操作為主，口試、筆試為輔。同時，堅持平時表現與考試考核并舉的形式對學生進行知識、能力和素質等方面的綜合評價，即按照平時考勤、提問和作業成績占總成績20％、理論考試和實驗成績（包括實驗操作考核、實驗課表現、實驗報告等）各占40％的分配比例進行課程成績的綜合評定，從而使本課程的成績考核既符合高職以過程為導向的課程觀和以行動為導向的教學觀，又實現了考試過程的全程化和考試手段的多元化；既增加了考試的靈活性，又調動了學生實踐操作的積極性，取得了較好的教學效果。

在2008年和2009年由教育部高等學校高職高專生物技術類專業教學指導委員會組織的兩屆生物技能大賽活動中（含微生物操作技能競賽），我院生物制藥專業的學生分別獲得了團體一等獎一項、個人一等獎二項、二等獎和三等獎各一項的好成績。